攀枝花市沙门菌临床分离株血清型和分子分型特征分析

陈 嫣， 崔 琳， 黄伟峰， 封正娟， 刘 玥， 许学斌

（1. 攀枝花市疾病预防控制中心，四川 攀枝花 617000；2. 上海市临床检验中心，上海 200126；3. 四川省疾病预防控制中心，四川 成都 610000；4. 上海市疾病预防控制中心，上海 200336）

目前，沙门菌（Salmonella）已经成为影响人类健康的重要生态行为传染病病原菌之一，其血清型有2 659个，依据临床症状分为自限型、肠道腹泻型和肠外侵袭型，暴露因素以食源性和养殖宠物等常见[1-2]。非伤寒沙门菌导致的散发与暴发疾病在欧美等发达国家属首位疾病负担的食源性疾病，该菌亦是我国公共卫生和食品安全领域最常见的食源性致病菌[2]。攀枝花市于2018年入选国家致病菌识别网的省属监测点，基于优化的沙门菌临床病例监测和定点医院的实验室确诊病例，通过菌株表型复核、耐药与分子分型特征分析，初步掌握本地区沙门菌血清型和耐药与分子流行基线特征，为应对潜在的食源性或侵袭性散发、暴发疫情提供生物背景和溯源样本参考。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

收集2018—2019年攀枝花市4家哨点医院基于优化监测方案培训与病例的90株沙门菌临床分离株，其中分离自肠道感染性腹泻病例79株、肠外散发感染性病例11株（血流散发9株、伤口1株、尿液1株），菌株经攀枝花市疾病预防控制中心微生物实验室鉴定确认。体外药物敏感性试验质控菌株大肠埃希菌（ATCC 25922）和分子分型质控菌株布伦登卢普沙门菌（H9812）由攀枝花市疾病预防控制中心微生物实验室自行保存。

1.2 试剂和仪器

亚硝酸盐煌绿增菌液、1型抗原诱导培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板、沙门菌显色琼脂平板和肠道菌筛选双糖管（上海安科生物制品有限公司）；沙门菌分型血清60种和适配诱导血清（丹麦SSI诊断公司）；14种抗菌药物定量检测板CHNMCMM（美国赛默飞世尔公司）；限制性内切酶XbaⅠ（英国Biolabs公司）；低熔点琼脂糖、CHEF Mapper脉冲凝胶电泳仪和Gel DocXR凝胶成像仪（美国伯乐公司）；VITEK 2 Compact自动化鉴定药敏仪、菌液比浊仪（法国生物梅里埃公司）。

1.3 方法

1.3.1 沙门菌血清型和临床病例特征 收集90例沙门菌感染病例临床流行病学特征数据，按肠道内和肠道外感染病例进行分类，将原发或继发性血液（流）或体液感染病例定义为侵袭性沙门菌型；按照世界卫生组织（World Health Organization，WHO）推荐的沙门菌O&H抗原标准化鉴定流程进行菌株血清型复核，基于同行验证，并通过我国已公开的沙门菌型数据库与国内、省内的沙门菌新菌型进行比对[2-3]。

1.3.2 体外药物敏感性试验 按照我国国家致病菌识别网技术方案测试90株沙门菌对14种抗菌药物（氨苄西林、头孢他啶、氨苄西林-舒巴坦、亚胺培南、四环素、萘啶酸、头孢西丁、氯霉素、头孢噻肟、头孢唑啉、庆大霉素、氨曲南、环丙沙星和复方磺胺甲噁唑）的耐药性。折点判断依据2019年美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）标准（耐药率包含耐药和中介菌株）[4]。多重耐药菌（multiple-drug resistance，MDR）定义：至少同时耐3种和（或）以上不同类型抗菌药物；ACT/S：耐氨苄西林（A）-氯霉素（C）-复方磺胺甲噁唑；ACT/ST：耐氨苄西林（A）-氯霉素（C）-复方磺胺甲噁唑（T/S）-四环素（T）。采用χ2检验（P<0.05）比较不同菌型菌株的耐药率。

1.3.3 分子分型 按照国家致病菌识别网统一的沙门菌脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）参数对90株沙门菌进行分子分型和图谱分析。以H9812为质量对照，限制性内切酶为XbaⅠ，37 ℃酶切2 h、电泳时间19 h。胶块用GelRed染料（美国Biotium公司）染色30 min，用纯水脱色60 min，图谱经成像仪和BioNumerics（6.5）分析软件作聚类与分析，聚类图类型根据非加权配对算术平均法构建，要求最优化值为0.5%，条带位置差异容许度为1.0%。

2 结果

2.1 沙门菌感染病例的临床流行病学特征

2018年9月—2019年8月，攀枝花市4家哨点医院90例沙门菌感染病例中，肠道腹泻型和肠外侵袭型病例分别为79例（87.78%，79/90）和11例（12.22%，11/90）。沙门菌感染病例的三间分布特征显示，男性病例明显多于女性（性别比为55∶35）；病例年龄分布：<5岁（29例）、5～19岁（11例）、20～59岁（29例）、≥60岁（21例），病例相对集中在<5岁和成年人中；肠道腹泻病例发病时间在2019年春夏季（尤其在5～7月）存在月度峰值（7月的腹泻病例数接近20例），平均月度腹泻病例超过10例；肠外侵袭型病例没有明显季节性，有2例肠炎沙门菌感染病例（17岁和76岁男性各1例）同时在其粪便和血液中分离到肠炎沙门菌。

2.2 沙门菌血清型特征

90株沙门菌临床分离株经O&H抗原鉴定，有15种血清型，分布于A、B、C、D、E、H 6个群，以B群（56.70%）和D群（26.70%）的病例最多，居前5位的血清型分别为鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、斯坦利沙门菌、伦敦沙门菌和韦太夫雷登沙门菌。侵袭性血清型包括肠炎沙门菌（6株）、甲型副伤寒沙门菌（2株）、鼠伤寒沙门菌（1株）、德比沙门菌（1株）和乌撒拉茂沙门菌（1株），其中乌撒拉茂沙门菌经同行验证和攀枝花市医学情报站查新确认，属国内首次分离的侵袭性沙门菌血清型。见表1。

表1 90株沙门菌临床分离株血清型分布

2.3 体外药物敏感性试验结果

90株沙门菌对14种抗菌药物的耐药率居前3位的依次为环丙沙星（64.44%）、头孢唑啉（63.33%）、萘啶酸（60.00%）；MDR所占比例达48.89%；对复方磺胺甲噁唑、三代头孢（头孢他啶和头孢噻肟）、亚胺培南、氯霉素、氨曲南和氨基糖苷类（庆大霉素）仍高度敏感。46株鼠伤寒沙门菌和24株肠炎沙门菌对氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、四环素、萘啶酸、头孢唑啉、环丙沙星、复方磺胺甲噁唑等7种抗菌药物耐药和MDR构成差异有统计学意义（P<0.05）。有5株鼠伤寒沙门菌为ACT/S和ACT/ST耐药型，而肠炎沙门菌无此耐药型；肠炎沙门菌耐药特征为高耐氟喹诺酮类和氨苄西林，对头孢噻肟的耐药率（20.83%）高于鼠伤寒沙门菌（8.70%），但差异无统计学意义（P>0.05），见表2。肠外的2株甲型副伤寒沙门菌除对萘啶酸耐药，对环丙沙星中介外，对其他抗菌药物均敏感。

表2 90株沙门菌对14种抗菌药物的耐药率 %

2.4 分子分型

90株沙门菌经过PFGE、图谱聚类分析，整合包括血清型、耐药表型等多维信息，确认血清型明显优势的鼠伤寒沙门菌存在3个不同程度的流行克隆：2个为MDR克隆（19例）、1个为敏感克隆（18例），2个MDR克隆间的遗传相似度较高；肠炎沙门菌存在1个高度同源、对氨苄西林（氨苄西林-舒巴坦）和氟喹诺酮（萘啶酸和环丙沙星）高耐药的MDR流行克隆（21株）；3株伦敦沙门菌为典型MDR克隆；3株斯坦利沙门菌对抗菌药物完全敏感，且感染者发病时间相同，其中2株为同源性克隆；2株韦太夫雷登沙门菌对抗菌药物敏感，亦有同源性克隆特征。分子分型结合耐药特征结果显示，90株沙门菌前5种优势血清型存在1个或多个典型的流行克隆。见图1。

图1 90株沙门菌PFGE聚类分析结果（限制性内切酶XbaⅠ）

3 讨论

致病菌识别网是我国参考发达国家主动监测食源性病原菌网络建立的传染病监测网络（PulseNet China）的升级版，但其本质还是被动监测。攀枝花市地处我国西南，毗邻长江上游，气候适宜，平均温度为20 ℃，居住人口约120万，经济水平位居四川省前列，自2018年加入监测网络后，基于医防结合促进临床实验室掌握沙门菌分离和鉴定的技术关键点，通过结果共享提升传染病网报精度，及时发现并报道了国内首例食源性暴露后继发血流感染的乌撒拉茂沙门菌（SalmonellaUzaramo）的罕见病例，促进了医疗机构对临床沙门菌感染诊疗技能的重视度[6-7]。

本研究4家哨点医院的沙门菌感染病例反映了本地区沙门菌肠内和肠外感染特征。腹泻型优势血清型为鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、伦敦沙门菌、斯坦利沙门菌、韦太夫雷登沙门菌，流行峰值在春夏季，男性病例多于女性，以<5岁幼儿（行为暴露）和20～59岁成人（食源性暴露）为主；侵袭性感染的优势血清型为肠炎沙门菌、甲型副伤寒沙门菌，无季节发病特征。本地区腹泻菌型特征与我国发达地区监测数据较一致：上海的鼠伤寒沙门菌低年龄组散发病例具明显优势（尤其在2012年之后），肠炎沙门菌在成年人组占优，符合食源性暴露特征[8-10]。美国自2012年之后，肠炎沙门菌成为腹泻型的首位血清型[11]。本研究肠外侵袭性病例的菌型与美国和我国发达地区一致[12]：肠炎沙门菌替代甲型副伤寒沙门菌成为居第1位的侵袭性血清型，间接证明了城市经济发展与卫生环境综合治理成效的提升，潜在影响食源性疾病总特征趋向发达国家或地区的疾病谱。

本研究菌型和耐药分析结果证实了攀枝花市沙门菌临床分离株的整体耐药性易受优势血清型耐药差异的影响。本研究中，鼠伤寒沙门菌MDR中和1类整合子有关的ACT/S和ACT/ST耐药型仅有5株，对复方磺胺甲噁唑、三代头孢、亚胺培南、氯霉素、氨曲南和氨基糖苷类抗菌药物高敏感；肠炎沙门菌未见ACT/S和ACT/ST，但对萘啶酸、环丙沙星的耐药率较高，与文献报道[13]一致，且对头孢噻肟的耐药率超过20%，符合我国主流血清型的耐药特征[14]，对其中产超广谱β-内酰胺酶菌株的CTX-M酶基因型值得研究。本地区肠炎沙门菌对抗菌药物的耐药率高于鼠伤寒沙门菌，鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌的整体耐药水平低于国内发达地区[10，12，14]，间接证实了抗菌药物耐药性与养殖动物生产和医源性等对食源性感染性病原菌产生的不同影响，导致了同属同血清型菌株出现的耐药水平差异，而高耐药克隆株更易在同属同血清型菌株之间通过物流和人口流动发生传播扩散[15-16]。

通过聚集血清型、耐药性与分子分型，本研究发现肠内腹泻的5种优势菌型均存在不同程度的流行克隆。四川省内曾报道过鼠伤寒沙门菌的皮蛋克隆：暴发的鼠伤寒沙门菌感染多数与家庭“皮蛋料理”加工冷菜有关[17]。本地区鼠伤寒沙门菌感染的临床散发病例存在3个流行克隆，其生态来源的多源性特征值得继续追溯；肠炎沙门菌单一MDR克隆病例呈高度散发，其对萘啶酸和环丙沙星均高耐药的情况也值得警惕[13]，肠外侵袭性肠炎沙门菌的MDR将加重疾病负担；病例相对较少的伦敦沙门菌MDR、斯坦利沙门菌、韦太夫雷登沙门菌均有稳定的克隆特征，提示根据血清型报告来发现和控制潜在食源性暴发的公共卫生监测是积极有效的[18-19]。

致病菌识别网可在区域经济建设不断发展和人口流动频繁的情况下做好主要传染病监测预警工作，但仍要应对各种挑战，应持续加强基于临床实验室诊断、提高医防合作的精准效率，共同应对人民群众逐渐升高的蛋白质消费与供应链带来的诸多食源性感染性疾病的防控挑战与疾病负担[1，20]。