呼和浩特地区腹泻患者艰难梭菌毒素基因多位点序列分型研究

王艳艳， 王俊瑞， 郑文琪， 申慧敏， 吕莹莹， 郭素芳

（内蒙古医科大学附属医院检验科，内蒙古 呼和浩特 010050）

艰难梭菌（Clostridium difficile）是一种专性厌氧、革兰染色阳性的粗大芽孢杆菌，是医院内抗菌药物相关腹泻和伪膜性肠炎的主要病原体[1]。为了解呼和浩特地区临床腹泻患者艰难梭菌感染情况，本研究对临床疑似抗菌药物相关腹泻和伪膜性肠炎患者粪便样本进行艰难梭菌分离和培养，并检测艰难梭菌毒素基因，对产毒艰难梭菌进行多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST），为艰难梭菌感染的诊治提供参考。

1 材料和方法

1.1 样本来源

收集2018年7月—2019年12月内蒙古医科大学附属医院疑似抗菌药物相关腹泻和伪膜性肠炎成人患者的粪便样本326份。

1.2 试剂与仪器

艰难梭菌显色培养基、厌氧产气袋、VITEK 2 Compact自动化鉴定药敏仪及配套ACT/ANC卡和VITEK MS微生物质谱鉴定系统（法国生物梅里埃公司），Efficiency 96基因扩增仪（北京领宇科技有限公司），聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）酶[天根生化科技（北京）有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 菌株培养及鉴定 将适量粪便样本与无水乙醇按1∶1体积混合，静置1 h后接种于艰难梭菌显色培养基。35 ℃厌氧培养48 h。选择显色平板上黑色、边缘不整，有特殊马粪味的革兰染色阳性大杆菌进行分离纯化。采用VITEK 2 Compact自动化鉴定药敏仪和VITEK MS微生物质谱鉴定系统进行菌种鉴定。

1.3.2 毒素基因检测 采用热激法提取细菌DNA，扩增艰难梭菌毒素基因（tcdA、tcdB）和二元毒素基因（cdtA、cdtB），明确是否为产毒艰难梭菌菌株。

1.3.3 MLST 参考文献[1]扩增艰难梭菌7个管家基因（adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA和tpi）。引物由中美泰和生物技术（北京）有限公司合成，引物序列见表1。反应体系：2×pfu Master Mix 25 μL，上、下游引物（10 pmol/L）各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。反应程序：94 ℃预变性15 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃再延伸5 min。PCR产物分析：取 5 μL PCR 产物，在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳（180 V，110 mA，20 min），溴化乙锭染色后，在凝胶电泳成像仪下观察结果。扩增产物送中美泰和生物技术（北京）有限公司进行测序，测序结果通过http：//pubmlst.org/clostndium difficile进行比对，得到每株菌的ST型别。

2 结果

2.1 菌株鉴定及毒素基因检测结果

326份粪便样本中共分离出艰难梭菌46株（14.11%）。46株艰难梭菌中，有35株为产毒株，其中tcdA（-）、tcdB（+）型3株，tcdA（+）、tcdB（+）型32株，部分菌株电泳见图1。未检测到含二元毒素基因的菌株。

图1 艰难梭菌毒素基因tcdA和tcdB检测

2.2 MLST结果

35株产毒艰难梭菌的7个管家基因目的条带均清晰可见。MLST比对结果显示，35株艰难梭菌共检出13个ST型别（2、3、14、33、35、39、42、48、52、54、55、109、512），其中ST54型的菌株数量最多，有 8 株（22.9%）；其次是ST2型和ST55型，各有5株（14.3%）。未检测到高产毒株核糖体027型（ST1型）和核糖体078型（ST11型）。其中1株产毒菌株的7个管家基因扩增电泳见图2。MLST结果见表2。

图2 艰难梭菌 MLST管家基因PCR产物电泳结果

表2 35株艰难梭菌MLST结果

3 讨论

艰难梭菌为革兰阳性厌氧芽孢杆菌，是医院获得性腹泻最主要的病原菌。当广谱抗菌药物的应用破坏肠道正常菌群平衡时，产毒艰难梭菌会过度繁殖，导致肠道菌群失调，并释放毒素，引起腹泻。抗菌药物被认为是导致艰难梭菌感染的最大危险因素[2]。目前，艰难梭菌感染已成为严重的全球性公共卫生问题[3]。

不同国家和地区对艰难梭菌感染的报道有较大的差异，BAUER等[4]对欧洲34个国家106所医院的艰难梭菌相关腹泻流行病学特征调查结果显示，尽管欧洲各医院艰难梭菌相关腹泻流行情况有差异，感染率为0～36.3/万（平均4.1/万），但总体呈上升趋势。我国艰难梭菌感染率或分离率为12.6%～18.5%[5-6]。有学者分析了24家医院2009—2015年住院腹泻患者的病因，发现19%的腹泻是由艰难梭菌感染引起的[7]。本研究艰难梭菌检出率为14.11%。由于艰难梭菌分离培养条件苛刻，对检测人员要求较高，我国目前只有为数不多的临床微生物实验室开展了艰难梭菌的常规分离培养，导致艰难梭菌感染的实验室诊断不足以满足临床诊疗需求。

艰难梭菌主要产生肠毒素A（tcdA）及细胞毒素B（tcdB）2种毒素，部分高产毒株还可以产生1种二元毒素（cdtA、cdtB）。本研究共分离出35株产毒艰难梭菌，其中32株艰难梭菌同时产A、B 2种毒素，3株艰难梭菌只产B毒素。不同地区报道产毒类型也不尽相同。本研究产毒艰难梭菌以tcd（A+B+）双阳为主，未发现tcd（A+B-）型菌株，与文献[8-9]报道一致，与同俏静等[10]报道的54株产毒菌株中有53株tcdB（A-B+），仅1株为tcdA（A+B-），未检测到双阳性菌株的研究结果有差异，可能与不同地区流行菌株类型不同有关。

2002年以来，1种高产毒艰难梭菌在北美和欧洲暴发流行，即PCR-核糖体分型027型/脉冲场凝胶电泳分型NAPl型/限制性内切酶分型BI型（简称RT027/NAP1/BI）[11-12]。该型菌株引起的临床症状更加严重，且传播性更强，易复发、预后差，导致艰难梭菌感染发病率快速增加[12-13]。2005年，在荷兰又发现了另1种高毒力菌株——核糖体分型078型[14]。目前，我国有高产毒株、多重耐药菌株的个案报道，但没有出现艰难梭菌感染的暴发流行。黄海辉等[15]首次在国内分离到高产毒株核糖体078型，我国香港和内地也相继报道了艰难梭菌高产毒株核糖体027型[16-19]。

MLST是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法。该法通过PCR扩增多个管家基因内部片段并测定其序列，分析菌株的变异。MLST操作简单，结果能快速得到，并且便于不同实验室的比较，已经用于多种细菌的流行病学监测和进化研究。随着测序速度的加快和成本的降低，以及分析软件的发展，MLST逐渐成为常规的细菌分型方法。在我国，引起感染的艰难梭菌主要流行菌株为ST37型、ST35型和ST54型[20-21]。我国东部地区某教学医院ST81型艰难梭菌在医院内多病区播散[22]。有研究发现，ST81型艰难梭菌感染者的60 d死亡率明显高于非ST81型感染患者，而ST81型也占艰难梭菌感染复发病例的大部分[23]。

本研究MLST结果显示，呼和浩特地区艰难梭菌ST型别较多，有13种，主要型别是ST54型，其次是ST2型和ST55型。未检出高产毒株ST1型（核糖体027型）、ST11型（核糖体078型）。本地区艰难梭菌感染以散发为主，未出现某一型别的暴发流行。