程序化细胞死亡分子5在乳腺癌组织中的表达及其临床意义

刘秀芬， 敖洪峰， 敖金平

（1.上海市奉贤区中心医院病理科，上海 201400；2.上海市奉贤区南桥社区卫生服务中心外科，上海 201400）

乳腺癌是一种常见的女性恶性肿瘤，发病率居我国女性恶性肿瘤的第3位[1]。尽管乳腺癌目前已有较好的治疗方案，预后也相对较好，但局部复发或远处转移甚至死亡的患者仍较多[2]，发生转移的乳腺癌患者的预后较差。腋窝淋巴结转移是乳腺癌转移的主要途径，患者首次就诊时是否发生腋窝淋巴结转移可为肿瘤潜在转移的预测提供重要参考[3]。此外，是否发生腋窝淋巴转移及转移数量还与肿瘤复发及患者的预后密切相关[4]。乳腺癌细胞的浸润和转移是由多种细胞因子参与的复杂生物学行为，程序化细胞死亡分子5（programmed cell death 5，PDCD5）蛋白是一种新的凋亡正调控蛋白，在细胞凋亡过程中发挥重要的作用[5]。有研究结果显示，PDCD5在多种肿瘤组织中的表达明显低于正常组织，而PDCD5表达下降可阻断癌细胞的凋亡程度，增加癌细胞的侵袭和迁移能力，因此PDCD5与肿瘤的发生、发展、浸润及转移均密切相关[6]。本研究拟检测PDCD5在乳腺癌组织中的表达，并分析PDCD5与临床病理学参数及腋窝淋巴结转移的关系，初步探讨PDCD5在乳腺癌转移中的作用，为患者的临床评估提供参考。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2015年1月—2018年12月在上海市奉贤区中心医院行切除手术的乳腺癌患者160例，年龄（44.7±7.1）岁，其中<45岁85例、≥45岁75例。所有患者均经病理学证实，在术前均未进行放化疗和其他治疗，3年随访资料完整。按国际抗癌联盟2009版TNM分期标准[7]：Ⅰ～Ⅱ期128例，Ⅲ～Ⅳ期32例；有淋巴结转移72例，无淋巴结转移88例。收集所有患者癌组织样本及对应的癌旁（与癌组织的距离≥5 cm）组织样本。本研究经上海市奉贤区中心医院伦理委员会批准[编号：CS2019（12）]，患者及家属均知情同意并自愿签字。

1.2 主要抗体和试剂盒

兔抗人PDCD5单克隆抗体、鼠抗人雌激素受体（estrogen receptor，ER）单克隆抗体、羊抗人孕激素受体（progesterone receptor，PR）单克隆抗体、兔抗人人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）单克隆抗体、鼠抗人细胞周期蛋白（Cyclin）D1单克隆抗体、Ki-67蛋白单克隆抗体、兔抗人趋势化因子受体4（chemokine receptor 4，CXCR4）单克隆抗体、羊抗人E-钙黏蛋白（E-cadherin，E-cad）单克隆抗体均购自上海长岛生物技术有限公司，辣根过氧化物标记的羊抗兔IgG抗体购自上海沪峰化工有限公司，SP试剂盒购自美国Abcam公司，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组化法检测PDCD5、Cyclin D1、Ki-67、CXCR4、E-cad蛋白表达

将石蜡包埋的组织样本切成5 μm厚的切片，放入40%乙醇中，40 ℃水浴处理4 min，展开后置于60 ℃烘箱中烘片。用二甲苯脱蜡20 min，用梯度乙醇水化，加入3%过氧化氢，室温放置10 min，阻断内源性过氧化物酶活性，再对PDCD5、Cyclin D1、Ki-67、CXCR4、E-cad蛋白进行高温高压组织修复，采用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）冲洗，加入5%羊血孵育30 min，除去封闭液，加入一抗，置于4 ℃冰箱过夜。以PBS代替一抗作为阴性对照，次日取出后用PBS冲洗，每张切片滴加二抗，室温下孵育30 min，PBS冲洗5次，每次3 min，加入DAB显色剂，随后用PBS冲洗，终止显色，用水冲洗10 min，梯度乙醇脱水干燥，在CKX53光学显微镜（日本奥林巴斯公司）下观察组织样本。

1.4 PDCD5、Cyclin D1、Ki-67、CXCR4、E-cad蛋白表达阳性判定标准

由2位经验丰富的病理科医师对病理切片进行盲评。每张切片随机选5个高倍视野，每个视野随机取200个细胞进行计数。细胞出现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达，最终染色结果以阳性细胞在组织样本中的比例及阳性细胞染色强度综合判定。染色强度评分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞表达百分率评分：无阳性细胞为0分，<25%为1分，25%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。最终结果为以上2项得分的乘积，9～12分为强阳性（+++），5～8分为阳性（++），1～4分为弱阳性（+），0分为阴性（-）。

1.5 乳腺癌分子分型判定标准

乳腺癌的分子分型参考St.Gallen乳腺癌会议（2015年）国际专家共识的相关标准[8]，分型标准见表1。

表1 乳腺癌分子分型判定标准

1.6 腋窝淋巴结标记方法及计数

将清扫的腋窝淋巴结分为3组，以胸小肌为解剖标志，第1组淋巴结位于胸小肌下缘外侧，第2组淋巴结位于胸小肌后方上缘和下缘之间，第3组淋巴结位于胸小肌上缘内侧；位于胸大肌与胸小肌之间的淋巴结归为胸肌间淋巴结，背阔肌附近分布的淋巴结独立标记为背阔肌旁淋巴结，记录所有淋巴结数量。

1.7 随访

采用定期复查和电话相结合的方式随访5年，统计所有患者的无进展生存期（progression-free survival，PFS）和总生存期（overall survival，OS）。PFS定义为从病理学确诊日期至疾病进展或尚未进展的末次随访日期，OS定义为从病理学确诊日期开始至死亡或末次随访日期。

1.8 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计数资料以例或率表示，组间比较采用χ2检验。采用Spearman相关分析评估等级变量之间的相关性。采用Kaplan-Meier生存曲线分析PDCD5与乳腺癌患者生存率之间的相关性。采用Cox比例回归分析评估乳腺癌腋窝淋巴结转移的影响因素。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PDCD5蛋白在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达情况

PDCD5蛋白主要表达于细胞质中，乳腺癌组织中PDCD5蛋白的阳性表达率为25.0%（40/160），明显低于癌旁正常组织[60.0%（96/160）]（P=0.000）。见表2、图1。

表2 乳腺癌组织和癌旁组织中PDCD5的阳性表达率

图1 PDCD5在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达（免疫组化法，×400）

2.2 PDCD5蛋白表达与临床病理特征的关系

PDCD5蛋白表达与不同TNM分期、组织分化程度、是否有淋巴结转移、是否有肌层浸润、是否有脉管浸润及不同ER、PR、HER-2表达状态有关（P<0.05），与年龄、月经状态、肿瘤直径及分子分型无关（P>0.05）。见表3。

表3 不同临床病理特征乳腺癌患者PDCD5表达的比较 例（%）

续表3 例（%）

2.3 PDCD5蛋白表达与肿瘤转移相关指标的相关性

Spearman相关分析结果显示，PDCD5蛋白表达与腋窝淋巴结转移数目呈正相关（r=0.428，P=0.000）；与Cyclin D1、 Ki-67和CXCR4表达呈负相关（r值分别为-0.217、-0.220、-0.271，P<0.01），与E-cad表达呈正相关（r=0.464，P=0.000）。

2.4 乳腺癌腋窝淋巴结转移的危险因素分析

Cox比例回归分析结果显示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、低组织分化程度、肌层浸润、脉管浸润、PDCD5阳性、ER阴性、PR阴性、HER-2阳性是乳腺癌腋窝淋巴结转移的危险因素（P<0.05）。见表5。

表5 乳腺癌腋窝淋巴结转移的危险因素分析

2.5 PDCD5表达与乳腺癌患者生存的关系

PDCD5阳性患者5年OS和PFS分别为65.00%和33.00%，显著高于PDCD5阴性患者（40.83%和17.50%）（P<0.05）。见图2。

图2 PDCD5阳性和阴性乳腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲线

3 讨论

乳腺癌是引起女性癌症相关死亡的主要原因。在我国，乳腺癌的发病率以每年约3%的速度增长[8]。虽然近年来乳腺癌的临床诊断、治疗和发生、发展机制的相关研究取得了一定的进展，但乳腺癌的总体生存率仍较低，其中癌细胞转移是治疗失败的主要原因之一。恶性肿瘤细胞的浸润、侵袭在乳腺癌的发生、发展中起关键作用[9]，因此探讨肿瘤转移相关蛋白的表达有利于进一步明确肿瘤的发病机制。

PDCD5除具有促进多种细胞凋亡和抑制其增殖的作用外，还可影响细胞运动迁移与细胞黏附能力，使癌细胞可以抵抗失巢凋亡的发生，增加癌细胞的运动能力，使其更具侵袭性[10]。有研究结果显示，PDCD5蛋白可与正向调控凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3的半衰期，使其半衰期延长，从而参与细胞凋亡[11]。体外实验结果显示，在乳腺癌细胞中过表达PDCD5可明显提高癌细胞的运动能力，而经PDCD5抑制剂处理后，癌细胞的侵袭性明显下降[12]。临床研究结果显示，PDCD5蛋白在胃癌、卵巢癌、非小细胞肺癌组织中的表达量明显低于癌旁组织（P<0.05）[13-14]。WANG等[15]的研究结果显示，在已转移的乳腺癌患者病变组织中，PDCD5蛋白阳性组PDCD5 mRNA的相对表达量明显低于PDCD5蛋白阴性组（P=0.015）。本研究结果显示，乳腺癌患者癌组织中PDCD5蛋白的阳性表达率明显低于癌旁组织（P=0.000），提示PDCD5蛋白表达可能与乳腺癌的发生有一定的关系。本研究结果还显示，PDCD5蛋白与TNM分期、组织分化程度、是否有腋窝淋巴结转移、肌层浸润、脉管浸润及ER、PR、HER-2表达有关（P<0.05），PDCD5蛋白表达强度与乳腺癌腋窝淋巴结转移数目呈正相关（r=0.428，P=0.000），提示PDCD5与乳腺癌的临床进展之间有一定关系，PDCD5表达量下降可能促进了乳腺癌的转移。DENG等[16]的研究结果显示，HER-2过表达型乳腺癌的癌组织中PDCD5表达明显低于其他分子分型的乳腺癌。本研究结果显示，5种分子分型的乳腺癌组织中PDCD5表达差异均无统计学意义（P>0.05），这可能与本研究纳入的HER-2过表达乳腺癌患者例数较少有关。

有研究结果显示，多个癌基因及抑癌基因表达的相关蛋白，如Cyclin D1、CXCR4、E-cad等与癌细胞运动有关[17]。Cyclin D1是一种细胞周期蛋白，可与周期性依赖性蛋白激酶相互作用，促使细胞从G1期进入S期，缩短细胞周期，并加速细胞的增殖[18]。YOUSEF等[19]的研究结果表明，Cyclin D1在有肌层浸润和腋窝淋巴结转移的乳腺癌患者的癌组织中呈高表达。有研究结果显示，在非小细胞肺癌中转染PDCD5 siRNA可促进Cyclin D1的表达；PDCD5缺失会导致Cyclin D1在抵抗DNA损伤时受到明显抑制[20]。Ki-67是一种增殖抗原，可有效反映肿瘤细胞的增殖活性，是临床上检测恶性肿瘤增殖的标志物。CAIAZZO等[21]研究发现，与乳腺癌原发病灶相比，转移病灶中Ki-67的表达明显升高。在乳腺癌细胞中过表达PDCD5，可抑制癌细胞的转移，其原因可能与下调Ki-67有关[22]。CXCR4是介导趋化因子发挥功能的重要受体，与特异性配体CXCL12构成的信号转导通路共同参与了淋巴结细胞归巢、血管生成、细胞增殖及迁移等生物学行为[23]。徐娟等[24]的研究结果显示，在伴有淋巴结转移的乳腺癌、卵巢癌组织中，CXCR4 mRNA表达强度明显升高。胥丹等[25]的研究结果显示，PDCD5能显著抑制肝癌细胞系HepG2在体外的生长，促进其凋亡，其机制可能与PDCD5对CXCR4的调控有关。E-cad是钙黏蛋白超家族的重要成员。在肿瘤进展中，E-cad的异常表达可反映肿瘤细胞的侵袭能力、对药物敏感性和抗凋亡能力的变化[26]。LEFORT等[27]的研究结果表明，有淋巴结转移的乳腺癌患者癌组织中E-cad的表达低于无淋巴结转移者，且与HER-2的表达呈负相关（r=-0.382，P=0.000）。本研究结果显示，PDCD5蛋白表达强度与Cyclin D1、Ki-67和CXCR4呈负相关（r值分别为-0.217、-0.220、-0.271，P<0.05），与E-cad呈正相关（r=0.464，P=0.000）；Cox比例回归分析结果显示，PDCD5阳性是乳腺癌患者发生腋窝淋巴结转移的危险因素，提示PDCD5蛋白表达下调可能与乳腺癌淋巴结转移密切相关，与文献报道[28]一致。

有研究结果显示，PDCD5蛋白表达与激素受体阳性呈正相关，PDCD5阴性表达患者预后较差，复发和转移风险更高，且与激素受体表达呈正相关[29]。本研究结果显示，ER、PR阴性及HER-2阳性的乳腺癌组织中PDCD5的阳性表达率较低；Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，PDCD5阳性乳腺癌患者的5年OS和PFS显著高于阴性患者（P<0.05），提示PDCD5阴性的乳腺癌患者预后较差。由于本研究为单中心研究，纳入的病例数较少，因此本研究结果还需要大规模的多中心临床研究加以验证。

综上所述，PDCD5蛋白在乳腺癌组织中呈低表达，可能通过调控运动相关蛋白Cyclin D1、Ki-67、CXCR4及E-cad促进乳腺癌腋窝淋巴结转移，进而影响患者预后。