GPⅠa基因G873A、C807T位点在心脑血管疾病和糖尿病患者中的多态性分布

焦瑞宝，唐吉斌，周佳丽，朱娟娟，陈继中

（皖南医学院附属铜陵市人民医院临床检验中心，安徽 铜陵 244000）

心脑血管疾病具有高发病率、高致残率、高死亡率和高复发率等特点。流行病学统计结果表明，脑血管疾病已经超越心血管疾病、恶性肿瘤，成为我国居民首位致死原因，在我国，脑卒中的发病率为1 114.8/10万，其中缺血性脑卒中（又称脑梗死）占69.6%[1]。目前，由于不良生活习惯（抽烟、酗酒、低运动量、高糖和高脂饮食）的广泛存在，我国心脑血管疾病高发状况仍没有缓解的迹象，并有低龄化的趋势。血小板异常聚集可导致动脉血栓形成，而血栓形成是心脑血管疾病的主要病理生理学诱因。阿司匹林具有最充分的循证医学证据、最佳的经济效益比、最广泛的适应症，被世界各国医学指南一致推荐为抗血小板治疗的一线药物，在我国已被广泛应用于血栓性疾病、心血管疾病的一级和二级预防。但是，相关临床试验结果显示，有5%～45%的患者对阿司匹林治疗不敏感，即存在阿司匹林抵抗（aspirin resistance，AR）[2]。目前，AR的确切机制尚不明确。有研究发现，部分基因位点多态性与AR有关[3]。2019年底，我国糖尿病患者已经达到1.16亿例，长期、反复高血糖很容易诱发心脑血管疾病，甚至出现糖尿病性脑猝死或脑血管意外。本研究拟探讨阿司匹林药效相关血小板膜糖蛋白GPⅠa基因G873A、C807T位点在心脑血管疾病和糖尿病患者中的多态性分布，为临床抗血小板个体化治疗提供遗传学指导。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2018年9月—2020年10月铜陵市人民医院行阿司匹林药效相关血小板膜糖蛋白GPⅠa基因G873A和C807T位点检测的住院患者811例，其中心血管疾病患者106例（心血管疾病组），男71例、女35例，年龄（71.65±11.03）岁，包括冠心病、心肌梗死、高血压病、心功能不全等；脑血管疾病患者597例（脑血管疾病组），男359例、女238例，年龄（63.12±12.03）岁，包括脑梗死、脑卒中、椎基底动脉综合征、短暂性脑缺血发作等；糖尿病患者108例（糖尿病组），男70例、女38例，年龄（64.12±10.43）岁，包括2型糖尿病、2型糖尿病性周围神经病等。

1.2 主要仪器和试剂

ETC811基因扩增仪（苏州东胜公司），PyroMark Q24 MDx实时定量焦磷酸序列分析仪、MX-M型混匀仪（德国凯捷公司），D3024型高速离心机、MX-S型漩涡震荡器（美国赛洛捷克公司），脱氧核糖核苷三磷酸（日本TakaRa公司），DNA提取试剂盒、测序反应通用试剂盒（长沙三济公司）。

1.3 方法

采集所有研究对象静脉血2 mL，乙二胺四乙酸二钠抗凝，采用硅胶柱提取、纯化基因组DNA。将提取的DNA进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）。反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性25 s，56 ℃退火25 s，72 ℃延伸25 s，共35个循环；最后72 ℃延伸5 min。采用PyroMark Q24 MDx实时定量焦磷酸序列分析仪测定扩增产物GPⅠa基因G873A、C807T位点的基因多态性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，计量资料采用±s表示，多组间均数比较采用单因素ANOVA方差分析，两两比较采用q检验；计量资料以例（率）表示，组间基因型及等位基因分布状况比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3个组一般特征比较

3个组之间性别构成差异无统计学意义（P＞0.05）；心血管疾病组、脑血管疾病组、糖尿病组年龄依次升高（P＜0.05）。见表1。

表1 3个组一般特征比较

2.2 3个组GPⅠa基因G873A、C807T位点分布

GPⅠa基因G873A、C807T位点的野生型、杂合突变型和纯合突变型均同步出现，3个基因型在3个组中的分布差异有统计学意义（P＜0.05）。糖尿病组纯合突变型高于心血管疾病组和脑血管疾病组（P＜0.01），杂合突变型低于心血管疾病组和脑血管疾病组（P＜0.01）。心血管疾病组、脑血管疾病组和糖尿组之间等位基因A、T分布差异均无统计学意义（P＞0.05）。GPⅠa基因G873A、C807T杂合突变型和纯合突变型合计为47.17%～53.27%，等位基因A和T均为24.53%～31.48%。见表2。

表2 3个组GPⅠa基因G873A、C807T位点基因多态性分布 例（%）

2.3 3个组不同性别患者GPⅠa基因G873A、C807T基因型及等位基因分布

心血管疾病组男性与女性之间GPⅠa基因G873A、C807T位点基因型和等位基因分布比较，差异均无统计学意义（P=0.734、P=0.737）；脑血管疾病组男性与女性基因型和等位基因分布比较，差异均无统计学意义（P=0.927、P=0.749）；糖尿病组男性与女性基因型和等位基因分布比较，差异均无统计学意义（P=0.138、P=0.283）。见表3、表4和表5。

表3 不同性别心血管疾病患者基因型和等位基因分布比较 例（%）

表4 不同性别脑血管疾病患者基因型和等位基因分布比较 例（%）

2.4 3个组不同年龄患者基因型、等位基因分布比较

按照年龄将811例患者分为29～60岁组（228例）、61～70岁组（197例）、71～80岁组（273例）、81～94岁组（113例）4个年龄亚组，4个年龄组患者基因型、等位基因分布比较，差异均无统计学意义（P=0.530、P=0.941）。见表6。

表6 3个组不同年龄患者基因型和等位基因分布比较 例（%）

3 讨论

血栓形成是心脑血管疾病的主要病理生理学基础，当血管内皮受损时，机体通常会启动血小板激活和聚集机制。首先，血小板内皮胶原蛋白被激活，血液流速变慢，血小板表面的GPⅠa与血管性血友病因子（vascular von Willebrand factor，VWF）结合，血小板上的胶原蛋白受体活化，导致细胞内Ca2+浓度升高，促进血小板的变形和脱颗粒，而后血小板释放花生四烯酸（arachidonic acid，AA），环氧化酶（cyclooxygenase，COX）-1催化AA使其形成血栓素A2（thromboxane，TXA2）。阿司匹林可直接且不可逆地抑制COX-1和COX-2，抑制血小板合成TXA2[4]，TXA2具有强大的促血小板聚集作用，其生成减少最终会导致血小板聚集功能受到抑制。同时，阿司匹林还可以抑制低浓度胶原、凝血酶、抗原抗体复合物等引起的血小板聚集和释放反应及自发性凝集，发挥预防血栓形成的作用[5]。

阿司匹林是具有高危因素抗血小板指征心脑血管疾病患者长期使用的一级预防用药。5%～45%的患者对阿司匹林治疗呈非敏感反应，即存在AR。AR可以从以下2个方面定义：（1）临床抵抗，即患者在规律服用治疗剂量的阿司匹林后出现新的血管事件；（2）实验室抵抗，即通过实验室测定发现阿司匹林并未有效抑制血小板聚集[6]。目前，临床应用最为广泛的是用10 μmol/L的二磷酸腺苷作为诱导剂，其平均血小板聚集率≥70%；或者用0.5 mg/mL AA作为诱导剂，其平均血小板聚集率≥20%[7]。引起AR的常见因素有药物依从性差、药物吸收和代谢、药物间相关作用、血小板聚集通路激活、环境或生活方式、药物治疗人群的选择和基因多态性等，其中基因多态性被临床及科研工作者广泛关注[8]。孙洲亮等[9]分析了35例AR患者基因多态性，发现GPⅠa基因C807T杂合突变型（32例，91.43%）、G873A杂合突变型（31例，88.57%）明显高于对应的野生型。王林等[7]也发现GPⅠa基因C807T在阿司匹林抵抗组、半抵抗组的T等位基因频率高于阿司匹林敏感组。

本研究中，糖尿病组阿司匹林药效相关GPⅠa基因G873A和 C807T位点的纯合突变型高于心血管疾病组和脑血管疾病组（P＜0.01），杂合突变型低于心血管疾病组和脑血管疾病组（P＜0.01）；3个组基因型分布差异有统计学意义（P＜0.05），但等位基因分布差异没有统计学意义（P＞0.05）。有研究结果显示，糖尿病患者长期、反复高血糖会引起小血管和毛细血管损伤，伴发高血脂等可引起大血管动脉粥样硬化性改变、血管内膜及内膜下受损动脉壁病变[10]，我国有75%的糖尿病患者最终死于心、脑血管疾病[11]，提示对糖尿病患者和心、脑血管疾病患者发生AR概率更大，及早进行抗血小板治疗非常重要。

本研究中，患者年龄比较，心血管疾病组＞脑血管疾病组＞糖尿病组，可能是由3种疾病自身发病机制所决定的。进一步按照性别对3个组进行组内比较发现，3个组组内男性、女性患者基因型和等位基因分布差异均没有统计学意义（P＞0.05）；不同年龄患者基因型多态性分布和等位基因分布比较，差异也均没有统计学意义（P＞0.05）。

本研究还发现，GPⅠa基因G873A和C807T位点野生型、杂合突变型和纯合突变型均同步出现在1个病例上，杂合突变型（GA或CT）、纯合突变型（AA或TT）合计为47.17%～53.27%，等位基因A和T均为24.53%～31.48%，提示基因位点突变在人群中是非常普遍的现象，这种基因位点的突变可能会导致临床阿司匹林药效发生变化。目前，评价阿司匹林药效相关检测包括实验室抵抗、临床抵抗和基因位点多态性检测，而基因位点多态性检测与实验室抵抗、临床抵抗是不同层面上的检测，基因位点多态性检测是在遗传学基础上进行分析和评价，实验室抵抗是通过体外模拟凝血激活途径评价血小板聚集率，临床抵抗是发生新的血管事件，三者之间存在相关性，但是又不等同，前两者的检测都是为了避免出现临床抵抗的严重现象。

综上所述，阿司匹林药效相关基因GPⅠaG873A、C807T位点在人群中存在的突变现象较为常见，突变存在个体差异。另外，糖尿病患者纯合突变型发病率高于心血管疾病患者和脑血管疾病患者，基因多态性分布和等位基因分布与患者性别、年龄无关。2个基因位点纯合突变型、杂合突变型可能会影响临床阿司匹林抗血小板治疗效果，需密切关注，必要时建议更换抗血小板治疗药物。