呼伦贝尔地区MRSA耐药谱及分子流行病学特征分析

孙 刚，孙 辉，杜彦丹，李寅雁，李英智，董占柱，佟力军，彭 博

（1.内蒙古林业总医院 内蒙古民族大学第二临床医学院检验科，内蒙古 牙克石 022150；2.内蒙古民族大学附属医院检验科，内蒙古 通辽 028000 ）

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillinresistantStaphylococcus aureus，MRSA）是引起医院和社区获得性感染的主要病原菌，可以引起各种致死性感染，如心内膜炎、败血症和肺炎等。本研究对呼伦贝尔地区MRSA的耐药谱及分子流行病学特征进行分析，以期为临床防控和治疗金黄色葡萄球菌感染提供帮助。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

收集2012年1月—2017年6月内蒙古呼伦贝尔地区5家医院（内蒙古林业总医院、牙克石市人民医院、呼伦贝尔市人民医院、满洲里市人民医院、扎兰屯市人民医院）MRSA非重复临床分离株55株，其中分离自痰样本28株、分离自咽拭子样本和脓液样本各8株、分离自伤口分泌物样本7株、分离自中段尿样本4株。质控菌株腐生葡萄球菌（BAA-750）、金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）购自我国国家卫生健康委临床检验中心，葡萄球菌染色体mec基因盒（staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec）基因分型标准阳性对照菌株NCTC 10042（SCCmecⅠ型）、N315（SCCmecⅡ型）、85/2080（SCCmecⅢ型）、JCSC4744（SCCmecⅣ型）、HS663（SCCmecⅤ型）由内蒙古医科大学附属医院检验科惠赠。

1.2 主要仪器与试剂

Vitek 2 Compact自动化鉴定药敏系统及配套革兰阳性菌鉴定卡GP、革兰阳性菌药敏卡GP-67（法国生物梅里埃公司），Veriti型PCR仪（美国ABI公司），EPS600型琼脂糖凝胶电泳仪、4200 SF型凝胶成像系统（上海天能公司）。头孢西丁药敏纸片（英国Oxoid公司），金黄色葡萄球菌乳胶凝集试剂（广东环凯微生物科技公司），溶葡萄球菌素、引物、DNA ladder Marker、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂（北京梓熙生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株鉴定和MRSA筛查 所有金黄色葡萄球菌临床分离株均采用乳胶凝集试剂和Vitek 2 Compact自动化鉴定药敏系统进行复核，并采用头孢西丁纸片扩散法筛查MRSA。采用PCR检测所有金黄色葡萄球菌的mecA基因与femB基因，若mecA与femB基因皆为阳性，则判断为MRSA[1]。

1.3.2 体外药物敏感性试验 采用Vitek 2 Compact自动化鉴定药敏系统分析金黄色葡萄球菌对12种抗菌药物（红霉素、克林霉素、四环素、复方磺胺甲噁唑、环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、庆大霉素、利福平、利奈唑胺、万古霉素、替加环素）的耐药性，根据美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2017年版标准判读结果。

1.3.3 总DNA提取 采用细菌基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取菌株DNA，-20 ℃保存备用。

1.3.4 SCCmec基因分型检测 采用多重PCR进行SCCmec基因分型，参照文献[2]设计引物、扩增条件、反应条件。与标准菌株出现相同产物长度的条带为该SCCmec型别，SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及V型分别出现695、937、1791、1 287及518 bp。

1.3.5 多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST） 采用PCR扩增金黄色葡萄球菌染色体DNA上7个管家基因（arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi及yqiL）的可变区片段，根据文献[3]设计引物、 扩增条件、反应条件，PCR产物送北京梓熙生物科技有限公司进行纯化和测序，测序采用双向测通方法。

1.4 统计学方法

采用Whonet 5.6 软件进行细菌耐药性分析。MLST结果用 eBURST 软件进行分析，人工校对后将7个管家基因序列通过MLST数据库（http：//www.mlst.net）进行比对，获得每个管家基因的等位号码，综合所有等位号码来确定序列型别。获得ST型别后用eBURST软件进行克隆型聚类分析。

2 结果

2.1 SCCmec基因分型结果

55株MRSA中，SCCmecⅡ型3 2株（58.18%）、SCCmecⅤ型14株（25.45%）、SCCmecⅢ型6株（10.91%）、SCCmecⅠ型1株（1.82%）、无明确型别2株。SCCmec基因多重PCR扩增产物电泳图见图1。

图1 部分MRSA SCCmec多重PCR扩增产物电泳图

2.2 MLST基因分型结果

55株MRSA中，共检出10个基因型，ST59为优势型别（28株），以下依次为ST239和ST72（各6株）、 ST630（5株）、ST398（4株）、ST25（2株）、ST5和ST15（各1株），另发现2个可能新型别（已提交给分子分型和微生物基因组多样性公共数据库，尚未得到反馈）。

2.3 MLST联合SCCmec基因分型结果

55株MRSA中，ST59-MRSA-SCCmecⅡ型为优势型别，共检出22株（38.18%）；其次为T59-MRSA-SCCmecⅤ型和ST72-MRSASCCmecⅡ型，各检出6株（10.91%），检出率居第3位的是ST239-MRSA-SCCmecⅢ型，检出4株（7.27%）。见表1。

表1 MLST联合SCCmec基因分型结果

2.4 体外药物敏感性试验结果

55株MRSA对利奈唑胺、万古霉素和替加环素均敏感，对红霉素和克林霉素的耐药率分别为81.82%、78.18%，见表2。ST59型和ST239型对喹诺酮类、庆大霉素、利福平耐药率差异较大，ST59型MRSA对环丙沙星、庆大霉素的耐药率均仅为3.57%，未检出左氧氟沙星、莫西沙星、利福平耐药菌株；而ST239型MRSA对上述抗菌药物的耐药率均为83.33%；ST72型MRSA除对红霉素、克林霉素高水平耐药外，未检出对其他抗菌药物耐药菌株；ST239型MRSA对红霉素和克林霉素的耐药率（66.67%）低于ST59型（85.71%）和ST72型（83.33%）；见表3。

表2 MRSA对12种常用抗菌药物的药物敏感性试验结果 株（%）

表3 主要MLST型别MRSA对12种抗菌药物的耐药率 %

3 讨论

本研究对内蒙古呼伦贝尔地区55株MRSA进行SCCmec、MLST基因分型和抗菌药物敏感性试验，旨在了解本地区MRSA的耐药谱和分子流行病学特征。

SCCmec基因盒现分为11个型别，其中Ⅱ和Ⅲ型是医院感染MRSA的常见类型，含有甲氧西林耐药基因（mecA基因）和其他抗菌药物耐药基因[4]。本研究结果显示，55株MRSA以SCCmecⅡ型为主（58.18%），SCCmecⅤ型占25.45%，SCCmecⅢ型占10.91%，SCCmecⅠ型占1.82%，无明确型别占3.64%。这与我国大部分地区以SCCmecⅢ型为主的情况不一致，与延边地区（65.0%）、大连（56.7%）、沈阳（50.0%）[5-6]以SCCmecⅡ型为主相似，可能和这3个地区与内蒙古呼伦贝尔地区毗邻有关。

本研究结果显示，ST59-MRSA-SCCmecⅡ型M R S A为呼伦贝尔地区的主要流行株（38.18%）。MLST共检测出10个基因型，ST59为优势型别（50.91%），可能为呼伦贝尔地区的流行克隆株，这与相关文献报道的ST239-MRSA为最流行基因型[7-9]不一致。有研究结果表明，2016年我国MRSA最流行基因型已经发生改变，ST239-MRSA的检出率由2013年的42.4%降至2016年的11.6%（P＜0.001），ST59型和ST5型已经成为最常见的基因型[10]，与本研究结果一致。

本研究55株MRSA的药物敏感性试验结果与CHINET的统计结果相比，除对克林霉素的耐药率（78.18%）略高于全国水平（66.7%）外，对其他的抗菌药物的耐药率均低于全国水平，尤其是对环丙沙星和左氧氟沙星这2种喹诺酮类药物[11]。比较耐药谱间的差异后发现，本地区的流行株ST59对环丙沙星、庆大霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、利福平的敏感率较高，体现出MRSA耐药谱的地域特异性。

目前，MRSA的高耐药率仍是临床面临的严峻挑战。本研究分析了呼伦贝尔地区MRSA的分子流行病学特征，有助于为本地区MRSA的临床治疗、感染控制以及暴发流行监测提供科学的参考。