3种β缺失型地中海贫血基因型与表型分析

李育敏，蔡钦泉，覃俊龙，金 潇，陈亚琼，莫云均，李 悦，张秀明

（1.深圳市罗湖区人民医院医学检验科，广东 深圳 518001；2.深圳市罗湖区人民医院感染管理科，广东 深圳 518001）

β地中海贫血（简称地贫）大部分由β珠蛋白基因点突变引起，少部分因基因缺失而导致[1]。β珠蛋白基因簇上的大片段DNA序列缺失常见于δβ地贫和遗传性持续性胎儿血红蛋白血症（hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH）[1-2]。目前，有文献报道的中国人群大片段β缺失型地贫至少有5种，其中3种属于δβ地贫，包括中国型缺失、云南型缺失和广州型缺失，均为Gγ（Aγδβ）0，另外2种分别为东南亚型-HPFH缺失和台湾型缺失[1-2]。此外，有研究在中国人群中还发现了2种小片段β缺失合并β点突变，分别为CD89-93（-14bp）合并-28和CD54-58（-13bp）合并IVS-Ⅱ-654[3]。我国南方地区以中国型Gγ+（Aγδβ）0和东南亚型-HPFH[4-5]多见，其他β缺失型地贫的相关报道较少。由于我国大部分医院采用的地贫基因诊断试剂盒仅能检测常见的β基因点突变类型，较为少见的β基因缺失尚需通过其他方法进行检测，如临床对β缺失型地贫血液学特征不熟悉，则易漏诊该类地贫。本研究针对深圳市罗湖区人民医院近年来发现的中国型Gγ+（Aγδβ）0、东南亚型-HPFH和台湾型β地贫及其合并其他类型地贫时的血液学表型进行分析，为罕见β地贫的筛查和临床遗传咨询提供参考。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2016年6月—2019年5月深圳市罗湖区人民医院接受血红蛋白（hemoglobin，Hb）电泳检测的门诊和住院患者72 397例。采集HbF≥5%、年龄≥6个月患者的外周静脉全血2 mL，乙二胺四乙酸二钾抗凝，2～8 ℃保存，用于红细胞参数检测、Hb电泳检测、地贫基因检测和DNA测序。

1.2 仪器与试剂

Hb电泳检测采用Capillarys2全自动毛细管电泳仪（法国Sebia公司）。红细胞参数检测采用XN-1000血细胞分析仪及配套试剂（日本Sysmex公司）。地贫基因检测采用Hema T960 PCR扩增仪（珠海黑马公司）、ChemiDoc MP全自动凝胶成像分析仪（美国Bio-Rad公司）、DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂）、YNH16恒温杂交仪及配套试剂（深圳亚能公司）。DNA测序采用3730XL遗传分析仪（美国ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 血液学分析 采用毛细管电泳法进行Hb电泳检测，电泳图分为Z1～Z15区，分区鉴别Hb条带类型，并分析各条带所占比例，主要观察HbF带和HbA2带。红细胞参数主要观察Hb、红细胞平均体积（mean corpuscular volume，MCV）和平均红细胞血红蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）。严格按仪器和试剂盒说明书进行操作。

1.3.2 地贫基因检测 采用聚合酶链反应-反向斑点杂交法检测3种α地贫缺失型基因（--SEA、-α3.7和-α4.2）、3种α地贫非缺失型基因（αQS、αCS、αWS）和17种β地贫基因点突变类型（-28、-29、CD17、CD41-42、CD43、βE、CD71-72、IVS-Ⅱ-654、-32、-30、CAP、Initiation condon、CD14-15、CD27-28、IVS-Ⅰ-1、IVS-Ⅰ-5、CD31）。采用跨越断裂点-聚合酶链反应检测中国型Gγ+（Aγδβ）0、东南亚型-HPFH和台湾型β缺失型地贫。所有检测和结果判读均按试剂盒说明书要求进行。

1.3.3 DNA测序 DNA测序由深圳亚能公司完成。采用聚合酶链反应扩增Hb电泳检测结果异常样本α1、α2和β珠蛋白基因[6]。采用Sanger双脱氧链终止法检测珠蛋白基因序列。通过Vector NET 8.0软件比对测序结果，运用人类异常血红蛋白和地中海贫血数据库（http：//globin.bx.psu.edu）查找突变位点。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量资料用表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因型检测结果

检出19例中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫患者，携带率为0.026%（19/72 397），其中2例为中国型Gγ+（Aγδβ）0复合-α3.7缺失杂合子、1例为中国型Gγ+（Aγδβ）0复合βE突变；检出18例东南亚型-HPFH地贫患者，携带率为0.025%（18/72 397），其中4例为东南亚型-HPFH复合--SEA缺失杂合子；检出3例台湾型地贫患者，携带率为0.004%（3/72 397）。见表1。

表1 β缺失型地贫的基因型与血液学表型检测结果

续表1

2.2 血液学表型检测结果

单纯中国型Gγ+（Aγδβ）0杂合子、单纯东南亚型-HPFH杂合子和单纯台湾型杂合子地贫患者MCV和MCH水平均降低，HbF水平均升高。单纯中国型Gγ+（Aγδβ）0杂合子和单纯东南亚型-HPFH杂合子地贫患者Hb水平均正常，单纯台湾型杂合子地贫患者Hb水平稍有下降。单纯中国型Gγ+（Aγδβ）0杂合子地贫患者HbA2水平正常，单纯东南亚型-HPFH杂合子地贫患者HbA2水平正常或升高，单纯台湾型杂合子地贫患者HbA2水平升高。见表1。

3种地贫患者MCV、MCH、HbF、HbA2水平差异均有统计学意义（P=0.000），见表2。单纯β缺失杂合子与合并其他类型地贫MCV、MCH、HbF、HbA2比较结果见表3。

表2 3种单纯β缺失杂合子地贫的血液学参数比较

表2 3种单纯β缺失杂合子地贫的血液学参数比较

注：*与中国型Gγ+（Aγδβ）0比较，*P＜0.05；与东南亚型-HPFH比较，#P＜0.05。

基因型 MCV/fL MCH/pg HbA2/% HbF/%中国型Gγ+（Aγδβ）0 69.1±2.2 22.7±1.1 2.5±0.2 15.4±2.6东南亚型-HPFH 75.0±5.3* 25.5±1.8* 3.9±0.8* 23.8±5.2*台湾型 64.7±4.1# 20.2±2.1# 6.4±1.1*# 8.0±2.4*#P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 单纯β缺失杂合子与合并其他类型地贫血液学参数 x±s

3 讨论

β珠蛋白基因簇的5个功能基因按照5'→3'的顺序分别为ε-Gγ-Aγ-δ-β，其大片段缺失累及δ和β基因引起的地贫被称为δβ地贫，按照分子缺陷和表型特征可分为GγAγ（δβ）0-地贫、Gγ（Aγδβ）0-地贫、（εγδβ）0-地贫和Hb Lepore[7]。此外，β基因簇大片段缺失还可导致HPFH，即成人体内持续存在过量的胎儿HbF。根据基因缺陷不同，HPFH可分为缺失型和非缺失型两大类，前者根据发现人群、缺失片段的大小和位置，可分为HPFH-1型～7型和French、French West-Indies和Algeria β缺失[8-9]。在中国人群中最常见的是中国型Gγ+（Aγδβ）0和HPFH-6型（东南亚型-HPFH），HPFH-6型是我国目前唯一发现的HPFH类型，缺失范围累及β基因和3'-HS-1区域，缺失长度为27 kb[4，8]，而前者缺失范围累及部分Aγ、全部δ基因、β基因和3'-HS-1区域，缺失长度为78.9 kb。本研究结果显示，中国型Gγ+（Aγδβ）0与东南亚型-HPFH在深圳地区β缺失型地贫中占多数，携带率分别为0.026%和0.025%。另外，本研究还发现3例台湾型，该缺失于2008年由HUANG等[10]首先在中国台湾地区发现，后在中国大陆人群中也有个例报道[11]，其缺失长度为1 357 bp，5'端断裂点落在β基因的Cap位点（位于-548），3'端断裂点落在β基因的IVS-Ⅱ位点（位于+810）。

γ珠蛋白基因因在患儿出生前后关闭而迅速减少，HbF（α2γ2）在患儿6个月时一般不超过5%，1岁时一般不超过1%[1]。β缺失导致HbF水平升高的机制尚不完全清楚，有学者认为该机制可能为β基因簇上多个参与基因表达调控的元件失控，影响了γ基因的发育开关转换，导致患儿出生后HbF水平持续升高，使得γ基因替代β基因功能，从而缓解了α与β肽链的不平衡[8，12]。β基因簇中有2个表达γ链的基因，即Gγ和Aγ，因此组成HbF的为Gγ和Aγ链，≥1岁患儿Gγ和Aγ的含量比为40%∶60%。中国型Gγ+（Aγδβ）0和东南亚型-HPFH由于缺失的分子基础不同，HbF以及Gγ和Aγ的含量均存在差异。东南亚型-HPFH的HbF水平通常较中国型Gγ+（Aγδβ）0更高，其杂合子可高达29%[4]，这可能与Gγ和Aγ导致HbF水平升高的机制有关[8，12]。东南亚型-HPFH的HbF水平升高的机制主要为：（1）缺失高敏位点3'-HS-1后，失去对γ基因表达的抑制，导致γ基因仅受上游5'端基因座控制区（locus control region，LCR）的正调控，同时又缺失了β基因的竞争作用；（2）缺失使3'端下游的增强子更靠近γ基因而产生较强的正效应，即增强子距离效应；（3）缺失γ基因沉默子，使本应关闭的γ基因持续表达[8，12]。然而，中国型Gγ+（Aγδβ）0缺失还涉及到部分Aγ和邻近Aγ基因3'端的增强子，这可能是导致Gγ和Aγ表型差异的主要原因[8，12]。另外，中国型Gγ+（Aγδβ）0的断点位于Aγ基因的 IVS-Ⅱ，保留了完整的Gγ基因，因此其HbF的Aγ含量明显减少，Gγ含量可高达72%～100%，而东南亚型-HPFH的Gγ含量仅略高于正常值，为57%～63%[12]。

本研究选取年龄≥6个月、HbF≥5%的患者进行中国型Gγ+（Aγδβ）0、东南亚型-HPFH和台湾型3种罕见β缺失型地贫检测，结果显示，3种地贫单纯缺失杂合子以东南亚型-HPFH的HbF水平最高，中国型Gγ+（Aγδβ）0次之，台湾型最低；而HbA2水平以台湾型最高，东南亚型-HPFH次之，中国型Gγ+（Aγδβ）0最低；3种地贫患者HbF和HbA2水平差异均有统计学意义（P＜0.05）。此外，3种地贫患者MCV和MCH水平差异也均有统计学意义（P＜0.05）。但当两两比较时，东南亚型-HPFH较其他2种地贫更高（P＜0.05），而中国型Gγ+（Aγδβ）0和台湾型差异无统计学意义（P＞0.05） ，这与杜丽等[4]的研究结果相符。台湾型地贫的HbA2在3种地贫中最高，为（6.4±1.1）%；HbF最低，为（8.0±2.4）%。机制可能与缺失的分子基础有关，其缺失长度在3种地贫中最短，范围累及β基因的启动子至IVS-Ⅱ，不包括第三外显子和3'端非翻译区，因此其血液学表型更类似β基因点突变。

中国型Gγ+（Aγδβ）0与其复合-α3.7缺失杂合子相比，血液学参数差异无统计学意义（P＞0.05）；中国型Gγ+（Aγδβ）0复合βE的MCV和MCH均较单纯杂合子低，而HbF水平升高，无HbA；东南亚型-HPFH与其复合--SEA缺失杂合子相比，仅MCH存在差异，但后者的MCV和HbF均较前者更低，可能需要更多样本来进行统计分析。通常情况下，β缺失复合α地贫，α基因和β基因表达均减少，使α链和β链合成相对平衡，临床多表现为轻型地贫，但是也存在异质性[4]；而β缺失复合β地贫，2种突变均位于β基因上，导致β链合成更低或不合成，α链主要合成HbF和HbA2，而无HbA或仅少量HbA形成，临床表现为中间型或重型地贫[4]，表明单纯β缺失杂合子与复合其他类型地贫的表型差异主要与其合并的地贫类型有关。鉴于成年男性和女性的Hb参考区间不同，本研究按性别分别统计了各β缺失型地贫患者的血液学参数，分析了MCV、MCH、HbF和HbA2指标的差异，而未进行Hb的比较。

综上所述，3种β缺失型地贫均以HbF升高为特征，临床应注意鉴别其血液学表型，并进行地贫基因检测以明确基因型。另外，HbF水平升高还可见于非缺失型HPFH 和δβ地贫，以及妊娠和骨髓恶性肿瘤等[12-14]，临床应注意区分其原因，以避免漏诊和误诊。