细菌超声分散计数仪在结核分枝杆菌最小抑菌浓度检测中的应用

郁晨蕾，江 渊，李 静，王莉莉，陈 炜，沈旭晖，张阳奕

（上海市疾病预防控制中心结核病检测实验室，上海 200336）

耐药结核病（resistant tuberculosis，R-TB）的防治是我国结核病防治工作中的难题之一，随着GeneXpert MTB/RIF检测系统在疑似肺结核病患者检测中的广泛应用，越来越多的利福平耐药结核病（rifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB）患者被确诊[1]。一线、二线抗结核药物的体外药物敏感性试验在个体患者的治疗和人群结核病的防控中都起着重要作用[2]。TREK Sensititre MYCOTB药敏板（简称MYCOTB，美国赛默飞世尔公司）可测定12种一线、二线抗结核药物的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），相较于传统固体比例法药物敏感性试验，有着耗时少、单次可检测多种药物、药物敏感性试验结果更精细等优点[3-5]。因MYCOTB在需要判读多个孔内细菌的生长情况时对细菌的接种量有着极其严格的要求，使其在临床应用上存在双人判读结果不一致和重复试验结果不一致的问题。

MYCOTB操作手册建议采用玻璃珠振荡研磨法对菌株进行研磨分散，用配套浊度仪定量，菌悬液需要多次稀释定量以达到目标浓度。接种于药敏板的菌液终浓度受人为因素影响较大，多次稀释容易产生大量气溶胶，存在实验室生物安全隐患。细菌超声分散计数仪利用超声波分散原理，可以实现细菌分散与浊度检测的同步，快速、简单、安全[6]。本研究将细菌超声分散计数仪应用于结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）药物敏感性试验，对比2种菌悬液制备方法的效果，通过肉眼观察、抗酸染色镜检、药敏板中菌落形态和药物敏感性试验结果，评估细菌超声分散计数仪在MTB MIC检测中的应用价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

以上海市疾病预防控制中心结核病检测实验室收集保藏的23株耐多药MTB临床菌株（编号1～23），5株全敏感MTB临床菌株（编号24～28）为研究对象，MTB标准菌株H37Rv（ATCC 27294）由中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心结核病参比实验室提供。

1.2 主要仪器与试剂

BACspreader 1100细菌超声分散计数仪（简称1100分散仪，广东体必康生物科技有限公司）；Sensititre微生物鉴定药敏分析系统[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]，包括Vortex-Genie2多功能漩涡混合器（Cole-Parmer）、手工比浊仪、AIM-自动菌液接种系统、Vizion-自动微生物药敏分析系统、MTB药敏板（MYCOTB，含12种不同浓度抗结核药物）、振荡管（含玻璃珠和含0.5% Tween-80的0.9%NaCl溶液）、0.5麦氏单位标准管、0.9%NaCl溶液。

1.3 制备菌悬液

1.3.1 玻璃珠震荡法 采用接种环挑取改良罗氏培养基（瑞士罗氏公司）斜面适量菌落，放入振荡管中，在漩涡混合器中振荡30 s，在室温条件下静置15 min后，放入手工比浊仪器中，滴加0.9%NaCl溶液混合及定量，调整菌悬液浓度至0.5麦氏浊度。

1.3.2 分散仪法 采用接种环挑取改良罗氏培养基斜面适量菌落，放入含2 mL无菌0.9%NaCl溶液的超声分散专用试管中，将试管放入1100分散仪，超声分散30 s（超声分散5 s，暂停5 s，实际对细菌超声分散15 s）。按照仪器显示屏上显示的数字，加入相应体积的0.9%NaCl溶液，调整菌悬液浓度至0.5麦氏浊度。

1.4 药物敏感性试验

取100 μL制备好的菌悬液，加入11 mL Middlebrook 7H9培养基（美国BD公司）中混匀，采用AIM-自动菌液接种系统分装至96孔MYCOTB中，每孔100 μL。完成后将MYCOTB贴上封膜，放置在37 ℃温箱中孵育。培养10 d后，采用Vizion-自动微生物药敏分析系统判读结果，并拍照保存。每个药敏板都由双人判读，以第1个人的判读结果为标准，第2个人的判读结果用于评估2个人判读结果的一致性。

1.5 质量控制

每批药物敏感性试验均以MTB标准菌株H37Rv（ATCC 27294）作为质控菌株。玻璃珠震荡研磨法中，每批试验前均用配套的0.5麦氏单位标准管对所用的比浊仪进行校准；分散仪法中所用的1100分散仪使用前均进行浊度校正。

1.6 统计学方法

采用SPSS15.0软件和Excel 2007软件进行数理整理和分析。对2种方法制备菌悬液的MIC药物敏感性试验结果进行一致性检测（Kappa检验），以Kappa值≥0.75为2种方法一致性较好。

2 结果

2.1 分散效果

应用玻璃珠震荡研磨法和分散仪法制备28株MTB临床菌株和MTB标准菌株H37Rv（ATCC 27294）0.5麦氏浊度的菌悬液。肉眼观察结果显示，分散仪法制备的菌悬液比玻璃珠振荡研磨法更均匀，无明显大的菌落颗粒（图1）。取2种方法制备的0.5麦氏浊度的菌悬液各1滴，紫外照射固定2 h后抗酸染色，显微镜下观察，镜下可见分散仪法制备的菌悬液比玻璃珠振荡研磨法分散更均匀，细菌成团较少（图2）。

图1 2种方法制备的菌悬液分散效果比较

2.2 药敏板中菌落形态

根据MYCOTB说明书要求，经过10 d 37℃温箱培养后，将MYCOTB放入Vizion-自动微生物药敏分析系统进行结果判读。结果显示，相较于玻璃珠振荡研磨法，分散仪法制备的菌悬液细菌生长活力更好，孔中细菌生长面积更大，结果更易判读（图3）。

图3 2种方法制备的菌悬液在MYCOTB中的菌落形态

2.3 药物敏感性试验结果

28株MTB临床菌株和MTB标准菌株H37Rv（ATCC 27294）的MIC值结果和药物敏感性试验比对结果显示，2种不同前处理方法制备的菌悬液对12种一线和二线抗结核药物（链霉素、异烟肼、乙胺丁醇、利福平、氧氟沙星、莫西沙星、阿米卡星、利福布汀、对氨基水杨酸、乙硫异烟胺、环丝氨酸和卡那霉素）的符合率均为100%，Kappa值均为1.00，仅有8株菌株的乙胺丁醇、2株菌株的环丝氨酸和3株菌株的卡那霉素的MIC值存在1个梯度的量化误差。由于这些量化误差均不处于MTB对各药物的耐药浓度附近，故不影响结果的判读。见表1、表2。

表1 玻璃珠振荡法和分散仪法制备菌悬液进行药物敏感性试验的MIC值 μg/mL

续表1

表2 2种方法制备的菌悬液药物敏感性试验结果比较 株

3 讨论

菌悬液的制备和定量是MTB药物敏感性试验，尤其在MIC药物敏感性试验这类定量试验中的关键操作[6]。目前，我国大多数结核病实验室主要采用研磨棒研磨和玻璃珠振荡的方法进行菌落分散，通过标准麦氏比浊管或比浊仪进行定量，多次加入含0.5%Tween-80的0.9%NaCl溶液进行逐步稀释比对，最终获得目标浓度的菌悬液。上述2种方法在研磨、多次稀释混合中均会产生大量气溶胶，存在生物安全隐患。同时，由于是手工操作，细菌悬浮液的均匀度受细菌研磨时间等人为因素影响，样本个体之间存在很大差异，这也是影响药物敏感性试验结果的最常见的人为因素[7]。细菌超声分散计数仪通过超声波在液体中的空化作用来分散菌落，分散、浊度检测和稀释体积计算的整个过程在一个封闭的空间中完成[8]，不需要移动液体，减少了污染，最大程度地确保了生物安全性，并大大提高了效率。

本研究通过肉眼观察、抗酸染色镜检、药敏板中菌落生长形态和药物敏感性试验结果比对，对玻璃珠振荡研磨法和分散仪法制备的菌悬液的药物敏感性试验结果进行评估。结果显示，相较于玻璃珠振荡研磨法，分散仪法对MTB分散得更均匀，无明显大的菌落颗粒，且抗酸染色镜检未见明显菌体聚集现象。有多项研究将手工研磨处理的菌悬液和分散仪处理的菌悬液进行比较，结果均显示分散仪对微生物菌落的分散效果更好[6-8]。本研究比较了玻璃珠振荡研磨法和分散仪法对菌落的分散效果，结果仍是分散仪的分散效果更均匀，说明应用超声波在液体中的空化作用来分散菌株的效果要远优于手工和机械物理研磨。冯通明等[6]的研究结果也证实了只要分散时间不超过120 s，超声并不会影响菌体的生长活性。

本研究中，将采用2种方法制备的菌悬液接种于MYCOTB 37 ℃培养10 d后，接种分散仪法制备的菌悬液的药敏板孔内菌落面积更大，更便于检测人员通过Vizion-自动微生物药敏分析系统判读结果。由于药物敏感性试验是定量试验，MYCOTB需要检测人员在1个视野下观测96孔板中各个孔内菌落的生长情况，这给MIC药物敏感性试验结果的判读带来挑战。有研究结果显示，MYCOTB存在双人判读结果不一致的情况[2]，分散仪法能很好地解决这一问题。这可能是由于分散仪法制备的菌悬液分散均匀，且无大颗粒菌块，使得96孔板中每个孔内细菌的接种菌量相对稳定、分散，使得相同培养时间内接种分散仪法制备的菌悬液的药敏板孔内菌落面积更大，提高了双人判读的一致率。

以美国临床实验室标准化协会液体培养基中抗结核药物耐药临界浓度为耐药判断依据[9]，本研究2种菌悬液制备方法得到的药物敏感性试验结果显示，12种抗结核药物的耐药性结果符合率为100%；但有8株菌株的乙胺丁醇、2株菌株的环丝氨酸和3株菌株的卡那霉素2种方法制备的菌悬液药物敏感性试验的MIC值存在1个梯度的量化误差。后续我们对这些存在1个梯度误差的样本进行了重复性试验，发现玻璃珠振荡研磨法制备的菌悬液的MIC值存在前后2次结果不一致的情况，而分散仪法的重现性则非常好。提示接种菌量的差异可能导致MIC检出结果出现上下1个浓度差异的结果。国外也有研究结果显示，在MYCOTB 药物敏感性试验中，增加或减少接种浓度会极大降低部分药物MIC值的重现性[10]。由于临床上耐受乙胺丁醇、链霉素、阿米卡星和莫西沙星这类抗结核药物的菌株的耐药浓度常处于判定耐药与否的临界浓度附近[11-12]，导致药物敏感性试验结果中的梯度误差会造成上述药物药物敏感性试验结果的误判，所以分散仪法可提高药物敏感性试验这类定量试验中接种菌量的精确性，增加MIC值处于临界浓度的临床菌株药物敏感性试验结果的准确性。

综上所述，细菌超声分散计数仪可以提高MTB菌悬液制备的自动化程度，尤其在药物敏感性试验这类定量试验中，可改善接种菌量的精确度和结果判读的一致性，减少人为因素引起的定量误差，有利于检测的标准化和重现性。