耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌对替加环素的敏感性及药物敏感性试验的临床应用

刘 妍， 袁应华

（同济大学附属第十人民医院检验科，上海 200072）

替加环素是一种甘氨酰环素类抗菌药物，具有广谱抗菌活性，且临床使用方便，不需根据肾功能受损情况调整剂量[1-2]。虽然大规模的监测研究表明，替加环素对大多数临床常见分离菌株（除铜绿假单胞菌外）的耐药率仍然在10%以下，但随着临床的广泛应用，替加环素耐药问题逐渐显现，已有一些研究表明替加环素耐药率在产超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum beta-lactamases，ESBLs）、多重耐药（multiple drug resistance，MDR）、广泛耐药（extensive drug resistance，XDR）、耐碳青霉烯类药物的细菌中出现升高[3-5]。由于目前美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）仍缺乏关于替加环素体外敏感性试验的判断标准，实验室用于检测替加环素体外敏感性的方法影响因素较多，所以替加环素敏感性检测方法的选择需慎重[6]。

本研究分析耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌对替加环素的敏感性，希望通过试验比较，找到适合临床实验室的用于替加环素体外敏感性检测的方法，以便为临床使用替加环素治疗耐碳青霉烯类药物细菌感染提供尽可能快速和可靠的依据。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

收集同济大学附属第十人民医院2013年11月—2014年2月临床分离，并经Vitek 2 compact全自动微生物分析系统（简称Vitek 2）菌种鉴定和Vitek 2、纸片扩散法体外药物敏感性试验确认为耐碳青霉烯类药物的菌株，其中肺炎克雷伯菌20株、鲍曼不动杆菌41株。在受试菌株中，31%来源于重症监护病房，41%来源于急诊重症室，18%来源于脑外科。将菌株置40%甘油肉汤-20 ℃冷冻保存。药物敏感性试验质控菌株为大肠埃希菌（ATCC 25922）。

1.2 仪器与试剂

Vitek 2及配套革兰阴性菌鉴定卡GN和革兰阴性菌药物敏感性卡GN13均为法国生物梅里埃公司产品，替加环素最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）测试条为意大利Liofilchem公司产品，替加环素标准品为美国Sigma公司产品，水解酪蛋白胨肉汤和替加环素、阿米卡星等药物敏感性纸片均为英国Oxoid公司产品。

1.3 体外药物敏感性试验

将61株冷冻保存的菌株复苏并传代，采用Vitek 2进行菌种鉴定，Vitek 2、纸片扩散法、MIC法、微量肉汤稀释法进行包括替加环素在内的药物敏感性试验。Vitek 2及配套细菌鉴定卡GN、药物敏感性卡GN13、MIC测试条均严格按照产品使用说明书进行操作。纸片扩散法和微量肉汤稀释法参照CLSI推荐的方法[7-8]进行操作。

1.4 药物敏感性结果判读标准

替加环素敏感性的判读标准[1，9]：肺炎克雷伯菌参照美国食品与药品监督管理局（U.S. Food and Drug Administration，FDA）肠杆菌科标准，MIC法敏感、耐药的判读标准分别为≤2 mg/L、≥8 mg/L，纸片扩散法敏感、耐药的判读标准分别为≥19 mm、≤14 mm；鲍曼不动杆菌参照FDA鲍曼不动杆菌标准，MIC法敏感、耐药的判读标准分别为≤2 mg/ L、≥8 mg/L，纸片扩散法敏感、耐药的判读标准分别为≥16 mm、≤12 mm。其他抗菌药物的敏感性：参照CLSI M100-S25文件中关于肠杆菌科以及不动杆菌属的判读标准[10]进行判读。基本一致性（essential agreement，EA）为被评估方法MIC值与微量肉汤稀释法MIC值相差不超过1个稀释度的菌株百分比。分类一致性（categorical agreement，CA）为被评估方法药物敏感性结果（敏感、中介、耐药）与微量肉汤稀释法一致的菌株百分比。非常重大误差（very major error，VME）为被评估方法将耐药误判为敏感。重大误差（major error，ME）为被评估方法将敏感误判为耐药。小误差（minor error，mE）为被评估方法将中介报告为耐药或敏感，或将耐药、敏感报告为中介。可接受范围为：CA≥90%，EA≥90%，VME≤1.5%，ME≤3%，mE≤10%[2]。

1.5 统计学方法

数据采用WHONET 5.6软件进行分析。

2 结果

2.1 鲍曼不动杆菌对除替加环素外的其他临床常用抗菌药物的敏感性分析

除对左氧氟沙星、米诺环素、复方磺胺甲噁唑、头孢哌酮-舒巴坦外，41株鲍曼不动杆菌对其余抗菌药物的耐药率均＞90.0%。见表1。

表1 41株鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药物的敏感性[%（株）]

除对复方磺胺甲噁唑、米诺环素外，20株肺炎克雷伯菌对其余抗菌药物耐药率均≥90.0%。见表2。

表2 20株肺炎克雷伯菌对临床常用抗菌药物的敏感性[%（株）]

2.2 3种检测方法对于替加环素的敏感性分析

20株耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌对替加环素的耐药率、中介率和敏感率，纸片扩散法结果分别为5.0%、70.0%、25.0%，MIC法结果分别为0.0%、5.0%、95.0%，微量肉汤稀释法结果分别为5.0%、0.0%、95.0%。见表3。

检测41株耐碳青霉烯类药物鲍曼不动杆菌对替加环素的耐药率、中介率、敏感率，纸片扩散法分别为17.1%、82.9%、0.0%，MIC法分别为0.0%、41.5%、58.5%，微量肉汤稀释法分别为7.3%、29.3%、63.4%。见表3。

2.3 MIC法和纸片扩散法与微量肉汤稀释法检测结果的比较

MIC法检测替加环素的敏感性结果与微量肉汤稀释法比较，20株耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌的EA、CA、VME、ME、mE均在可接受范围内，而41株耐碳青霉烯类药物鲍曼不动杆菌的CA和mE欠佳。纸片扩散法与微量肉汤稀释法比较，EA、CA、VME、ME、mE不理想。见表4。

2.4 61株细菌对替加环素和米诺环素的敏感性分布

采用微量肉汤稀释法检测41株耐碳青霉烯类药物鲍曼不动杆菌对替加环素和米诺环素的敏感性，结果显示二者同时耐药2株，同时中介2株，米诺环素中介而替加环素敏感17株，米诺环素耐药而替加环素中介10株，米诺环素耐药而替加环素敏感9株，还有1株为替加环素耐药而米诺环素中介。

表3 3种方法检测耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌对替加环素的敏感性

表4 MIC法和纸片扩散法与微量肉汤稀释法检测结果的比较 [%（株）]

采用微量肉汤稀释法检测20株耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌对替加环素和米诺环素的敏感性，结果显示二者同时敏感14株，一致率为70%。米诺环素中介或耐药株替加环素的MIC值有不同程度的升高。

3 讨论

本研究61株细菌对大部分抗菌药物的耐药率为90.0%～100.0%，由于XDR定义[11]中所涉及的部分抗菌药物无法常规检测，因而将本研究所选菌株定义为耐碳青霉烯类药物细菌，其中31%样本来源于重症监护病房，41%的样本来自急诊重症室，18%的样本来自脑外科，这些科室均为医院感染监控重点科室，也是医院耐碳青霉烯类药物细菌检出率居前3位的科室，主要以鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌为主。上述科室大多数患者具有病情严重且复杂、住院时间较长、自身免疫力低下、长期使用广谱抗菌药物、接受侵入性操作（如手术、中心静脉置管、气管插管等）普遍且频繁等特点，产生对替加环素耐药的相关因素较多。替加环素的耐药常出现于包含替加环素在内的抗菌药物治疗以及碳青霉烯类药物使用之后，其耐药性的发生、发展可能与这些抗菌药物的选择性压力有关；此外，在某些部位的感染（如尿路感染、血流感染和腹腔脓肿等）存在时，由于替加环素本身的药物浓度分布以及体内代谢特点，细菌常常暴露于亚抑菌浓度状态下，这也可能是导致细菌对其不敏感的因素之一[12-14]。因此，应当重视这些科室的耐碳青霉烯类细菌对替加环素敏感性的监测。本研究结果显示，耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌对替加环素的敏感率为95.0%，而耐碳青霉烯类药物鲍曼不动杆菌的敏感率仅为63.4%。

本研究采用MIC法检测耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌对替加环素的敏感性。MIC测试条类似于E-test测试条，MIC法因操作简便，适用于单个样本的检测，而较容易应用于临床[1-2，6]。本研究结果显示，MIC法检测耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌对替加环素的敏感性在使用FDA标准进行判读时与微量肉汤稀释法具有很好的一致性；而对耐碳青霉烯类药物鲍曼不动杆菌进行检测时，CA和mE超出可接受范围，因此其结果需谨慎对待[2]。

虽然有文献报道，纸片扩散法不适合用于耐碳青霉烯类药物鲍曼不动杆菌对替加环素敏感性的检测[2]，但由于微量肉汤稀释法操作较繁琐，MIC法成本较高，均不适用于临床常规筛查，因此本研究还是同时使用了纸片扩散法进行替加环素敏感性分析。与微量肉汤稀释法比较，纸片扩散法检测2种细菌的耐药率、中介率上升，敏感率下降，且2种细菌CA、mE等评价指标超出可接受范围，但多数菌株为微量肉汤稀释法敏感而纸片扩散法中介或微量肉汤稀释法中介而纸片扩散法耐药，未出现微量肉汤稀释法耐药而纸片扩散法敏感的结果。

从本研究61株细菌对临床常用抗菌药物的耐药率分析可见，米诺环素仍然表现出一定的抗菌活性，其对耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌的敏感率、中介率、耐药率分别为70.0%、20.0%、10.0%，对耐碳青霉烯类药物鲍曼不动杆菌的敏感率、中介率、耐药率分别为0.0%、48.8%、51.2%。本研究就米诺环素和替加环素的敏感性分布进行了分析，结果发现对于耐碳青霉烯类药物鲍曼不动杆菌二者结果一致率较低；对于耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌结果一致率为70%，并且米诺环素中介或耐药株替加环素的MIC值有不同程度升高。

综上所述，替加环素对耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌有较好的抗菌活性，而对耐碳青霉烯类药物鲍曼不动杆菌的抗菌活性下降，临床仍然需要对耐碳青霉烯类药物菌株进行替加环素抗菌活性的监测，尤其是在多重耐药高发的重点科室。对于耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌，MIC法检测替加环素结果与微量肉汤稀释法有较好的一致性，因此推荐MIC法用于临床常规检测或复核确认，而耐碳青霉烯类药物鲍曼不动杆菌的MIC法检测结果需谨慎对待，必要时用微量肉汤稀释法进行确认。虽然各项评价指标不支持使用纸片扩散法进行替加环素敏感性分析，但在临床实验条件有限的情况下，可将纸片扩散法作为筛查手段，需注意对于不敏感菌株应当谨慎解释，或进一步使用微量肉汤稀释法确认。耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌对米诺环素和替加环素的敏感性结果的一致率为70%，并且米诺环素中介或耐药株替加环素的MIC值有不同程度升高，因此对米诺环素敏感的耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌可尝试先使用替加环素纸片扩散法筛查，结果不敏感时可再考虑进行MIC法或微量肉汤稀释法复核。

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