异性骨髓移植后无精症患者Y染色体的检测

胡 莹， 梁先念， 于建红， 覃凌云， 王玉明

（1.昆明医科大学第二附属医院检验科，云南 昆明 650101；2.昆明医科大学第二附属医院男性科，云南 昆明 650101）

10%～15%的精子缺陷和男性不育是由遗传因素引起的，其中Y染色体AZF区微缺失是引起精子缺陷和男性不育的主要遗传因素之一。外周血染色体核型分析合并Y染色体AZF区微缺失检测对临床医师选择不同的辅助生殖技术和避免父代遗传基因缺陷有着重要的意义。然而，不同性别供者、受者之间进行骨髓移植，会形成稳定的嵌合体，染色体相关检测结果表现为供者型。本研究报道异性骨髓移植后无精症患者1例，其外周血Y染色体AZF区微缺失检测和染色体核型分析结果均显示无Y染色体，但口腔黏膜拭子Y染色体AZF区微缺失检测结果显示AZF区位点均存在。临床应对异性骨髓移植后无精症患者的外周血Y染色体AZF区微缺失检测结果加以重视。

1 材料和方法

1.1 研究对象

患者，男，33 岁，因无精症来昆明医科大学第二附属医院就诊。该患者于2000年确诊为慢性粒细胞性白血病。2001年在北京大学第一医院行骨髓干细胞移植术，供者为患者姐姐，术后恢复良好。2015年2月在昆明医科大学第二附属医院行精液常规检查，检查结果显示精子总数为0，且对精液高速离心后沉渣镜检也未见精子。睾丸彩色多普勒超声提示右侧睾丸大小为38 mm×22 mm×16 mm，体积为8.6 cm3；左侧睾丸大小为38 mm×21 mm×15 mm，体积为8.4 cm3。双侧睾丸体积偏小。

1.2 方法

1.2.1 外周血染色体核型分析 采集该患者外周血0.8 mL，运用肝素进行抗凝处理，置于淋巴细胞培养液中，恒温37 ℃培养72 h。收获前1小时加入秋水仙素，常规收获细胞，制片，G显带，分析 3～5个分裂相，计数20个核型，参照人类细胞遗传学国际命名体制（an International System for Human Cytogenetic Nomenclature，ISCN）（2005）[1]进行外周血染色体核型描述。

1.2.2 外周血Y染色体AZF区微缺失检测 采集该患者外周血3.0 mL，运用乙二胺四乙酸进行抗凝处理，运用多重聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）（北京爱普益生物科技有限公司人Y染色体AZF区微缺失核酸检测试剂盒）检测外周血Y染色体AZF区的8个序列标记位点（sequence-tagged site，STS）（AZFa区：sy84、sy86；AZFb区：sy127、sy134；AZFc区：sy254、sy255；AZFd区：sy145、sy152）。设正常男性为阳性对照，设正常女性为阴性对照。PCR 反应条件为95 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，57 ℃ 20 s，72 ℃1 min，4个循环；94 ℃ 15 s，56 ℃ 1 min，45个循环。运用2%琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测。

1.2.3 口腔黏膜拭子Y染色体AZF区微缺失检测 采集该患者口腔黏膜拭子样本，1 mL三羟甲基氨基甲烷缓冲液震荡，高速离心，将所有沉淀富集到离心管中，提取DNA后进行口腔黏膜拭子Y染色体AZF区微缺失检测。

1.2.4 血清生殖激素检测 采用ARCHITECT i2000SR全自动免疫分析系统（化学发光法）及配套试剂（美国雅培公司）检测血清泌乳素、卵泡刺激素、黄体生成素、雌二醇、孕酮、睾酮水平。

2 结果

2.1 外周血染色体核型分析结果

该患者外周血染色体核型分析结果为46xx。见图1。

图1 外周血染色体核型分析结果

2.2 外周血Y染色体AZF区微缺失检测结果

外周血Y染色体AZF区的8个STS均缺失，且Y染色体性别决定基因（sex-determining region Y，SRY）无扩增曲线。

2.3 口腔黏膜拭子Y染色体AZF区微缺失检测结果

口腔黏膜拭子Y染色体AZF区的8个STS均存在，且SRY均扩增到曲线。多重PCR扩增产物电泳结果见图2。

图2 Y染色体AZF区微缺失多重PCR扩增产物电泳图

2.4 血清生殖激素检测结果

该患者卵泡刺激素及孕酮水平均升高。卵泡刺激素水平为15.88 IU/L（参考区间为0.95～11.8 IU/L）；孕酮水平为0.84 nmol/L（参考区间为＜0.64 nmol/L）。该患者血清泌乳素水平为169.07 mIU/L（参考区间为72.66～407.40 mIU/L）；黄体生成素水平为6.23 IU/L（参考区间为0.57～12.07 IU/L）；雌二醇水平为90.12 pmol/L（参考区间为40.37～161.48 pmol/L）；睾酮水平为24.66 nmol/L（参考区间为4.94～32.01 nmol/L）。

3 讨论

遗传学异常是临床上导致男性不育的重要因素。随着生殖医学及男科学的不断发展，很多既往认为只能供精辅助生育的患者，可能可以通过睾丸显微取精术，行辅助生殖技术来助孕[2]。因此，遗传学检查对男性生殖疾病诊治来说越来越重要，其对指导临床治疗、提高辅助生殖技术的疗效和安全性、开展胚胎植入前遗传学诊断等方面都有着重要的意义。

染色体核型分析是最常用的男性生殖遗传学检查，男性染色体核型异常会导致不育[3]，Y染色体微缺失是导致无精症和严重少精症的一个重要遗传因素。在无精症和少精症患者中，AZF区微缺失的情况占3%～29%，其发生率仅次于Klinefelter综合征[4]。建议对非梗阻性无精症、严重少精症患者行Y染色体微缺失检测[5]。对原因不明的男性不育患者，可选择行Y染色体微缺失检测[6-7]。AZF区微缺失可垂直遗传，故建议有相关家族史者进行AZF区微缺失筛查[8]。

骨髓移植是在破坏受者造血系统的基础上，输入供者的骨髓细胞，使供者细胞在受者体内生长，受者造血系统得以重建。骨髓移植成功与否，与供者细胞在受者体内的植入状态，即与供者嵌合状态的建立和发展有关。当供者骨髓细胞完全占据受者的骨髓或外周血，即供者细胞完全植入时，为完全嵌合状态。如果供者为女性，受者为男性，可通过检测供者的Y染色体，来确定嵌合状态。

本研究中患者因无精症前来就诊，并行Y染色体微缺失检查。外周血Y染色体AZF区微缺失检测结果显示SRY无扩增，建议作外周血染色体核型分析，结果为46xx。通过对该患者病史进行详细询问，得知患者在十余年前进行了异性骨髓移植，可能为移植后嵌合状态。故采集患者口腔黏膜拭子样本进行Y染色体AZF区微缺失检测，结果为AZF区位点均存在。基本排除该患者无精症的病因为Y染色体AZF区微缺失的可能。无精症是否和患者行骨髓移植使用大剂量化疗药物有关，患者双侧睾丸体积偏小，是否与遗传性无精症有关，均需进行下一步检查才能明确病因。

对于无精症和严重少精症的患者，在行辅助生殖技术治疗前，必须进行染色体和Y染色体AZF区微缺失检测，以便临床医师进行预后判断，从而避免缺陷垂直遗传。本研究结果提示，临床医师应对异性骨髓移植后无精症患者加以重视，需考虑嵌合状态的情况，警惕把外周血染色体检测结果错判为受者的结果。应运用组织DNA检测结果来代表移植前的基因状态，如口腔黏膜细胞、病理切片组织等。有文献报道[9]，漱口水样本可用于受者移植前基因型的确定。本研究未尝试使用漱口水样本进行检测。除外周血之外，何种样本类型适用于Y染色体微缺失检测，还需增加病例数后再作进一步研究。

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