7种半胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测系统的分析性能评价

安崇文， 李海霞

(北京大学第一医院检验科，北京100034)

近年来，国内外研究表明半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystatin C，Cys C)已经成为反映肾小球滤过率功能受损的一个较理想的早期标志物［1-2］。目前Cys C检测系统较多，检测原理不尽相同。美国病理学家协会(CAP)室间质评结果显示Cys C检测存在差异性较大，2011和2012年度所有参加实验室的变异系数(CV)为13.3%～30.7%，且采用欧洲标准物质(ERM-DA471)进行的正确度评价未见报道。因此，我们对目前国内常用检测系统［包括5个颗粒增强胶乳透射免疫比浊法(particle-enhanced latex turbidimetric immunoassay，PETIA)检测系统、1个颗粒增强聚苯乙烯散射免疫比浊法(particle-enhanced polystyrene nephelometric immunoassay，PENIA)检测系统、1个胶体金均相溶胶颗粒免疫(colloidal gold homogeneous sol particle immunoassay，SPIA)检测系统］进行评价，分析其精密度、空白限(LoB)、抗干扰性以及正确度验证等性能，证实其是否能满足预期临床用途。

材料和方法

一、仪器试剂与样本准备

1.检测系统 5个PETIA检测系统和1个SPIA检测系统以A～F表示，PENIA检测系统简称为BNⅡ系统。各检测系统试剂、校准液批号见表1。

表1 检测系统来源详情

2.仪器 5个PETIA检测系统(A～E系统)和1个SPIA检测系统(F系统)均采用HITACHI 7600-110全自动生化分析仪，PENIA检测系统应用SIEMENS DADE BEHRING BNⅡ特定蛋白分析仪。

3.比对样本 选取患者样本46份，其Cys C浓度覆盖整个可报告范围，标本无黄疸、溶血、乳糜等干扰。

4.辅助试剂 生理盐水来自北京双鹤药业股份有限公司生产的0.9%氯化钠注射液(批号1107014W)，用于基础空白测定和稀释样本;干扰物质血红蛋白(Hb)自配，将新鲜乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血离心，去除血浆，加生理盐水洗涤红细胞，重复3次，再加去离子纯水使之溶血，配制成Hb干扰物;医用脂肪乳(C14-24)由西安力邦制药有限公司提供(批号:11080S)，用生理盐水稀释成甘油三酯(TG)浓度为4、8、15、28 mmol/L的干扰物。

二、评价方法

参考美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)评价方案对检测系统性能进行评价。

1.精密度评估 参考CLSI EP5-A2文件［3］。选取患者新鲜血清，自行配制3个浓度(0.8、2.7、4.7 mg/L)的混合血清。批内重复性:同一时间内连续测定20次。批间重复性:连续测定10 d，每天测定2批，每批测定1次，2批间隔＞2 h。计算批内、批间变异系数(CV)。根据美国临床实验室修正法案(CLIA'88)建议:批内CV＜1/4总允许误差(TEa)(即＜3.75%)，批间 CV＜1/3 TEa(即＜5%)［4-5］;基于 CLIA'88 对生物学变异设定的分析质量指标中建议Cys C的精密度应达到的理想目标为2.3%［6-8］。

2.正确度评估 参考 CLSI EP15-A2文件［9］。方法①:对欧洲Cys C有证参考物质ERMDA471/IFCC［其靶值±不确定度为(5.48±0.15)mg/L］进行检测，分析与靶值之间的偏倚;方法②:对2011年度和2012年3月CAP发放的Cys C室间质评物进行测定。根据CLIA'88建议，TEa＜±15%［4-5］，基于 CLIA'88对生物学变异设定的分析质量指标中建议Cys C的偏倚和TEa应达到的理想目标分别为3.4%和7.2%［6-8］。

3.空白限(LoB) 参考 CLSI EP17-A文件［10］。以生理盐水作为空白样本，每天检测2批，每批重复2次，连续5 d，共获得20个结果。将实验数据绘制成频数分布图，根据其分布类型再采用参数检验或非参数检验方法估计LoB。

4.抗干扰性评估 参考 CLSI EP7-A2文件［11］。收集低(0.8 mg/L)、高(7.3 mg/L)2 个浓度混合血清，在上述血清中加入Hb、TG干扰物，配制成Hb终浓度为10、13 g/L，TG终浓度为4、8、15、28 mmol/L的样本，对照样本加入等体积生理盐水，每份样本测定2次，取均值，以偏差＜±10%作为评判标准。

5.相关和偏差分析 参考CLSI EP9-A2文件［12］。各系统同时测定，每份样本测定2次，取均值，以BNⅡ系统(PENIA)为参考，分析PETIA与PENIA间的相关性和偏差。相关系数(r)要求＞0.975。

三、统计学方法

统计学分析采用Microsoft Excel 2003、SPSS 13.0 及 Medcalc 11.6.1 软件。相关性分析采用Pearson相关，P＜0.05为差异有统计学意义。偏差分析应用Bland-Altman差异分析法。

结 果

一、精密度评估结果

当Cys C 浓度为0.8～5.0 mg/L时，6个系统(A～F)和BNⅡ系统总批内CV均＜3.75%，总批间CV除E系统外均＜5%，重复性良好;其中D系统的精密度符合CLIA'88建议的理想目标(CV＜2.3%)。见表2、3。

二、正确度评估结果

1.A～E系统和BNⅡ系统测定ERM-DA471的绝对偏倚分别为0.00、0.00、1.01、－0.01、－0.50、－0.35 mg/L，相对偏倚分别为0%、0%、18.43%、－0.18%、－9.12%、－6.39%;F 系统未参与评估。其中A、B、D 3个系统符合CLIA'88建议达到的理想偏倚(3.4%)［6-8］。见表4。

表2 6个检测系统(A～F)和BNⅡ系统的批内精密度(%)

表3 6个检测系统(A～F)和BNⅡ系统的批间精密度(%)

表4 A～E系统和BNⅡ系统测定ERM-DA471的结果

2.仅D系统和BNⅡ系统测定CAP室间质评物的结果较为理想，满足CLIA'88建议的理想目标(TEa＜7.2%)［6-8］，其他系统均有 50% 的结果与CAP均值的相对偏倚超出CLIA'88建议的TEa(靶值±15%)。整体来看，PENIA测定结果低于PETIA。见表5。

三、空白限(LoB)实验结果

A～F系统和BNⅡ系统的LoB分别为0.00、0.00、0.31、0.01、0.10、0.06和＜0.05 mg/L。

四、抗干扰性验证结果

当Hb≤13 g/L、TG≤28 mmol/L时对A、B系统及BNⅡ系统无影响(干扰＜±10%)。C系统在TG≥4 mmol/L时呈正干扰;D系统在TG≥28 mmol/L时对低水平Cys C呈负干扰;E系统在Hb≥10 g/L时对低水平Cys C呈负干扰;F系统在Hb≥10 g/L时对低水平Cys C呈正干扰，在TG≥15 mmol/L时对低水平Cys C呈负干扰。见表6。

表5 6个检测系统(A～F)和BNⅡ系统测定CAP室间质评物的结果 (mg/L)

表6 6个(A～F)检测系统和BNⅡ系统抗干扰性验证结果 (mg/L)

五、相关性和偏差分析

A～F系统与BNⅡ系统的相关性较好，r分别为0.998、0.998、0.986、0.998、0.994、0.993，均＞0.975(P＜0.01)。Bland-Altman偏差分析显示A～F系统与BNⅡ系统的平均绝对偏差分别为－0.02、－0.10、－0.31、0.05、0.04、0.36 mg/L，平均百分偏差分别为－0.57%、2.58%、10.15%、4.92%、14.48%、8.06%。见图1。

图1 A～F系统与BNⅡ系统的偏差分析

讨 论

目前国内Cys C测定方法多种多样，原理各不相同。不同体系间的偏差导致以Cys C作为参数估算肾小球率过滤(eGFR)的方程多样性，这是由于测定Cys C的校准品不同，方法未一致化所造成的。因此Cys C的标准化问题受到高度重视，国际临床化学和实验室医学联盟(IFCC)成立了Cys C标准化工作组，工作组推荐将Cys C原级参考品添加到脱脂的人血清中，制备得到的次级标准物质(ERM-DA471/IFCC)具有良好的互通性。ERM-DA471在复溶物质中使用颗粒增强胶乳散射比浊、颗粒增强胶乳透射比浊和酶促单向免疫扩散3种方法来定量，有Dako、Roche Diagnostics、Siemens Healthcare Diagnostics 3 个检测系统参与。该定值由4个实验室各自检测，由7个可接受均值的未加权均值确定。目前在国内各系统之间测定ERM-DA471的正确度评估未见报道，国产Cys C试剂校准品溯源不统一，校准品赋值存在差异。为此，本研究选取国内常见6种检测系统在HITACHI系统进行分析性能验证，以期为临床应用提供信息。

正确度验证显示不同检测系统之间存在着差异，测定ERM-DA471显示PETIA法中 A、B、D 3个系统在可接受范围，而C、E、BNⅡ系统均超出规定的不确定度，最大偏倚可达到1 mg/L，最大相对偏倚为18.43%，准确性欠佳。检测系统的性能需要进一步改进。为进一步评价不同仪器检测系统间是否存在差异，我们对CAP室间质控物进行分析，其靶值统计是采用所有参与实验室按方法学或仪器分组计算中位数求得。按检测仪器不同分为HITACHI/ROCHE全自动生化仪系列和SIEMENS特种蛋白仪系列，结果显示采用HITACHI系列PETIA中仅D系统符合CLIA'88建议的理想TEa(7.2%)，SPIA也未能满足要求;BNⅡ系统测定CAP质控物偏倚虽然也在TEa(7.2%)允许范围内，但是其不同水平的测定结果均低于HITACHI/ROCHE系列检测系统。

抗干扰性验证显示C系统在TG≥4 mmol/L时对低水平和高水平样本均呈正干扰(干扰＞+10%)，可能与C系统使用单波长测定有关，使用单波长虽可提高检测灵敏度，但不能消除脂血、乳糜带来的浊度影响，建议C系统在测定脂血和乳糜血标本时增加第2波长;F系统在Hb≥10 g/L时对低水平样本呈正干扰(干扰＞+10%)，Hb≥13g/L时对高水平样本呈正干扰(干扰＞+10%)，考虑F系统是采用SPIA，其反应体系颜色的变化会影响Cys C的检测，因此溶血对样本测定影响较大。

6个系统(A～F)与BNⅡ系统相关性良好(r均＞0.975，P＜0.01)。Bland-Altman 差异分析显示6个系统(A～F)与BNⅡ系统之间的平均偏差和平均百分偏差相差较大，与文献［13］报道相符，其中C系统与BNⅡ系统的平均偏差为－0.31 mg/L;Cys C浓度在5.0 mg/L 以上时与BNⅡ系统偏差较大，高浓度样本检测比实际浓度偏低，可能是由于钩状效应的影响。当抗原量过剩时而出现的后带现象，导致免疫复合物的降低，应当稀释样本后重新进行测定。这也说明C系统的检测线性低于BNⅡ系统。F系统与BNⅡ系统的平均偏差为0.36 mg/L，有研究报道显示SPIA 与PENIA 有0.27 mg/L［14］或 32.7%［15］的正偏差，与本研究结论相似。其他4个系统(A、B、D、E)与BNⅡ系统的偏差相差不大，但E系统的百分偏差为14.48%，接近 CLIA'88建议的 TEa(靶值±15%)。可能是由于E系统的空白限偏高(为0.1 mg/L)，导致 Cys C 在0.8 mg/L以下的低浓度时与BNⅡ系统比较的百分偏差较大。有报道显示PETIA较PENIA有－0.16 mg/L的负偏差［16］，还有文献［17］报道称 PETIA 较 PENIA 有－0.009 mg/L 的负偏差，另有文献［15］报道显示PETIA较 PENIA有24.5%和27.6%的正偏差。这可能是由于市场上销售的Cys C试剂厂家众多，每种试剂中Cys C抗体的效价不同，尤其是各检测体系的校准品溯源不统一，校准品赋值存在差异，造成产品差异很大，严重影响其检测结果的准确性。如果采用准确赋值的校准品，有可能使不用检测体系对同一份样品的检测结果基本一致。本研究的不足之处是未能采用ERM-DA471验证各检测体系校准品赋值的准确性。

综上所述，A、B、D 3个系统的各项性能指标基本满足临床试验的要求;部分厂家Cys C检测试剂的准确性欠佳，且不同系统间结果存在一定偏差，是否可通过校正因子或统一校准品进行纠正，从而使检测结果在不同系统间达到一致可比有待进一步验证。临床应用中，实验室应选用分析性能优越的检测系统，通过参加室间质评或其他渠道验证其正确度。

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