B抗原减弱表型的表型频率与ABO基因分析

池 泉，张 爱，任本春

(福建省血液中心，福建福州350004)

ABO亚型通常根据其血清学特征进行分类，A 亚型可分为A2、A3、Aend、Ax、Am、Ay、Ael等，B 亚型的分类通常参照A亚型，但没有B2［1］。然而在日常ABO血型鉴定过程中，经常可遇到B抗原表达减弱(凝集强度中等)的样本，有些还可产生不规则抗-B，其血清学表现不符合B3、Bx、Bm和Bel等亚型的分类标准，在国内曾一度被认为应判定为B2亚型［2］。ABO基因变异导致糖基转移酶活性改变，是红细胞上A或B抗原表达异常的最常见原因。但以往对此类B抗原减弱表型多以血清学分析报道为主，未进行进一步的ABO基因分析。为更好地了解B抗原减弱表型的分子遗传学基础，我们在日常血型鉴定过程中收集了部分具有该特征的B型或AB型个体血液样本，对其血清学和ABO基因进行了初步分析。

材料和方法

一、研究对象

从2007年至2010年间在福建省血液中心献血的献血者241 952例中筛查出的B抗原减弱的献血者及部分家系成员。所有样本均为乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血。

二、血型血清学鉴定

采用单克隆抗-A、抗-B(上海血液生物制品公司产品)和A、B、O型红细胞(实验室自制)，对所有献血者进行ABO血型鉴定(正反定型，微孔板法);采用单克隆抗-A、抗-B、抗-H(上海血液生物制品公司产品)和人源抗-A、抗-B血清及A、B、O型红细胞(实验室自制)，用试管法凝集试验对筛查出的B抗原减弱个体(微板法呈弱凝集)及家系成员血样进行B抗原减弱表型的确认和血清学分析。

三、标本的DNA提取

使用基因组DNA纯化试剂盒(Qiagen公司产品)按照试剂说明书抽提B抗原减弱个体及家系成员样本的基因组DNA，用于ABO基因的聚合酶链反应(PCR)扩增与测序分析。

四、ABO基因第6、7外显子及第6内含子PCR扩增

以人类ABO基因(GenBank Accession Number NC_000009)为模板，应用 Primer3 Input软件(V0.4.0)(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)在线设计引物(F1:5'-GTGGTCAGAGGAGGCAGAAG-3'，R1:5'-TGTGTGTGATTTGAGGTGGG-3')用于扩增第6、7外显子及第6内含子共2 145 bp片段。PCR反应体系包括:dNTP 400μmol/L，Mg2+2.5 μmol/L，10×PCR 缓冲液5 μL，Taq 酶0.5 U，模板 DNA 500 ng，引物10 pmol/L，终反应体系50μL;循环参数:94℃热启动3 min，94℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃ 130 s;30个循环后 72℃10 min。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

五、ABO基因第6、7外显子及第6内含子序列分析

PCR产物经胶回收纯化后直接测序，测序引物为F1、R1、F2(5'-AGAGGATGCTGGCAGAGCCGTGGTC-3')、R2(5'-GGTGCCGAACAGCGGAGTCAGGAT3')。用Chromas 2.01软件阅读测序图谱，使用 DANMAN5.22软件将测定序列与B101序列进行比对。

结 果

一、血清学检查结果

从241 952名献血者(扣除重复献血者后，其中B型59 979名、AB型16 505名)中共检出B抗原减弱13例(其中B型9例、AB型4例)。据此估计，B抗原减弱表型在福建省人群中的频率约为1∶18 000，其中在B型人群中的频率约为1∶7 000，在AB型人群中的频率约为1∶4 000。检出样本的血清学检查结果见表1。

表1 13例B抗原减弱样本的血清学检查与ABO基因分型结果

二、ABO基因分析

根据各样本ABO基因第6、7外显子及第6内含子的序列比较结果，13例B抗原减弱样本的ABO基因型分别为:A102/Bw121例，B101/B101 2例，B101/O01 4例，B101/O02和 A102/B101各3例(见表1)。除在13号样本中检出Bw12等位基因外，其余样本的ABO基因均为常见等位基因。

三、家系调查

对1例基因型为B101/O01的献血者(8号)进行了家系成员的血型检测和分析，先证者父亲检出为具有相同的B抗原减弱表型，ABO基因型为B101/O01(见图1)。

图1 8号献血者的家系调查结果

讨 论

B亚型的血清学分类标准至今仍较不明确，其分类通常参照 A亚型，但没有 B2亚型。Salmon［3］曾在1976年提出参照A亚型的标准简单将 B 亚型分为B3、Bx、Bm、Bel，同时将不符合这4类亚型标准的其它弱表型归为Bw。对于B亚型血清学分类的讨论或共识较少，可能与高加索人群中B型以及B亚型的频率较低且案例较少有关。血型及其亚型在不同的人群中有不同的分布特征，例如在高加索人群中A2亚型约占A型人的20%，而在汉族人群则仅为0.5%;与西方人群A亚型频率高于B亚型的情况相反，东方人群的B亚型频率要高于A亚型。日本的Yamaguchi等［4］在对700 000名献血者的血型分析中，Bx和Bm的频率要高于Ax和Am;向东等［5］报道的上海地区ABO亚型的分析中，B亚型的频率也明显高于A亚型。

虽然B亚型分类中并无B2亚型，但上世纪90年代，我国曾有不少针对B型中是否存在B2亚型的讨论，并相继有10例以上的血清学个例分析报道［2，5］。有学者认为在B亚型分类中纳入与A2亚型相对应的B2亚型符合中国人群的实际［6］。概括所谓B2亚型的血清学特征主要为:红细胞与抗-B的凝集强度介于正常 B型与B3之间，与抗-H的凝集强度介于O细胞与B细胞之间，部分个体血清中可检出不规则抗-B。本研究中各样本红细胞与抗-B的反应强度均在2+左右，与抗-H的反应强度均增强，有2例样本检出了不规则抗-B，血清学特征与以往报道的B2亚型相似。本研究的筛查显示该表型在人群中具有一定的分布频率，其他地区该表型的人群频率、血清学特征，有待于更多研究者的进一步的识别、研究和分析。由于本研究B抗原减弱表型的筛查仅采用一个厂家生产的单克隆抗体试剂进行，若该类抗原减弱由部分抗原表位的缺失引起，采用来自不同克隆株的单克隆抗体试剂可能会得到不同的结果和发现。

ABO血型抗原的弱表达受多种因素的影响，其中以ABO基因酶催化活性区域的编码序列错义突变最为常见，是形成 ABO亚型的主要原因［1］。另外如ABO基因酶催化活性区域外的编码序列错义突变、糖基转移酶分泌不足、前体物质的变异或缺乏、其他转移酶的合成干扰等，也可能引起ABO血型抗原的弱表达。ABO基因全长18 kb，包含7个外显子，其中第6和7外显子占全部编码序列的77%。编码91%的ABO糖基转移酶催化活性区域，目前已报道的大多ABO亚型相关等位基因的点突变发生在该区域［7］。本研究中1例样本在第6外显子检出了278C＞T的突变(Bw12等位基因)，该突变导致B基因编码产物的第93位氨基酸由脯氨酸(Pro)转变为亮氨酸(Leu)。Bw12等位基因由许国先等［8］在1例 ABw亚型(与抗-B凝集强度为w)个体中首次发现并报道，为稀有等位基因。与之不同，本研究中的该例样本B抗原中度减弱，与抗-B的凝集还强于本研究中的其他B抗原减弱样本(见表1)。本研究从B抗原减弱个体中检出该等位基因，再次表明278C＞T突变对酶产物的活性具有一定影响，同时也再次验证ABO血型抗原的合成机制受多种因素影响，不同个体间即便含有相同的等位基因或突变也可能有着不同的血清学表现。本研究其余12例样本的第6和7外显子序列与常见等位基因相同，未发现存在突变，但其中1例的家系调查结果却提示B抗原减弱表型存在遗传的可能。已有研究表明［9-10］，部分ABO亚型的形成与ABO基因第1至5外显子、启动子区域和CBF/NF-Y增强子区域的突变有关，因此还需对ABO基因的其他序列进行检测，以明确这些弱表达是由ABO基因的其他区域突变引起，还是受非ABO基因的因素影响。

［1］Daniels G.Human blood groups［M］.2nd ed.Oxford:Blackwell Science publishing，2002:36.

［2］陈 忠，彭群新.关于对ABO血型系统B2亚型的若干认识［J］.临床检验杂志，1995，13(1):51-52.

［3］Salmon C.Proposed practical classification of week B phenotypes B3，Bx，Bel［J］. Rev Fr Transfus Immunohematol，1976，19(1):89-104.

［4］Yamaguchi H，Okubo Y，Tanaka M.A rare blood Bx analogous to Ax in a Japanese family［J］.Proc Jpn Acad，1970，46(3):446-449.

［5］向 东，刘 曦，郭忠慧，等.上海地区中国人群中ABO亚型的研究［J］.中国输血杂志，2006，19(1):25-26.

［6］李 勇，马学严.实用血液免疫学:血型理论和实验技术［M］.北京:科学出版社，2006:137.

［7］Human Genome Variation Society.Blood group antigen gene mutation database(BGMUT)［EB/OL］.(2013-09-10)［2013-09-25］.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gv/mhc/xslcgi.cgi?cmd = bgmut/systems_alleles＆system=abo.

［8］许先国，洪小珍，刘 瑛，等.α1，3半乳糖基转移酶新等位基因278C＞T的鉴定［J］.中华医学遗传学杂志，2006，23(6):631-634.

［9］Cai X，Jin S，Liu X，etal.Molecular genetic analysis of ABO blood group variations reveals 29 novel ABO subgroup alleles［J］.Transfusion，2013.［Epub ahead of print］

［10］Kominato Y，Tsuchiya T，Hata N，etal.Transcription of human ABO histo-blood group genes is dependent upon binding of transcription factor CBF/NF-Y to minisatellite sequence［J］.J Biol Chem，1997，272(41):25890-25898.