生存素与CD34在急性髓系白血病患者骨髓细胞中的表达

谷大伟， 马 莉

(贵阳医学院附属医院中心实验室，贵州贵阳550004)

白血病是造血干/祖细胞于分化过程的不同阶段发生分化阻滞、凋亡障碍和恶性增殖而引起的一组异质性的造血系统恶性肿瘤［1］。白血病在世界范围内的日渐高发且趋于低龄化也引起学者们的广泛关注，大量研究表明白血病的发生与癌基因的激活、抑癌基因的失活及细胞凋亡受抑有关［2］。生存素(survivin)又名存活素，是凋亡抑制蛋白家族中迄今为止最强的凋亡抑制因子［3］。survivin大量表达于胚胎及婴幼儿组织中，正常组织中只有少量表达，而在60余种肿瘤细胞株和大部分人体肿瘤组织中过度表达［4-7］，也包括白血病细胞系［8］。白细胞分化抗原34(CD34)是造血干细胞或(和)祖细胞的特异性标志，正常人骨髓中只有少量CD34+细胞，约占单个核细胞的1.0%～4.0%［9］，在急性髓系白血病(AML)细胞上则有较高频率的表达。多数学者认为AML中CD34的表达与AML的低缓解率及短生存期有关，仅少数学者认为CD34+AML与CD34－AML病例的缓解率、无病生存期无差异［10］。而关于AML患者骨髓细胞survivin基因与CD34共表达的研究鲜见报道。我们利用流式细胞术检测骨髓细胞中survivin和CD34的表达，探讨二者对白血病发生、发展的影响，从而为白血病的诊疗提供新思路、新方法。

材料和方法

一、对象

1.AML组 选取2010年4月至2011年1月贵阳医学院附属医院血液科收治的AML患者共62例，所有病例经临床及实验室检查确诊，符合世界卫生组织(WHO)诊断标准及英美法协作组(FAB)诊断标准［1］。其中男28例、女34例，年龄19～60岁。62例AML患者根据治疗后是否缓解分组。(1)治疗未缓解组:38例，确诊后经过2～4个月的临床治疗未达到目前公认的完全或部分缓解标准［1］;(2)治疗缓解组:24例，确诊后经过2～4个月的临床治疗达到目前公认的完全或部分缓解标准［1］。

2.对照组 2010年4月至2011年1月贵阳医学院附属医院血液科收治的非恶性血液病患者31例(包括缺铁性贫血13例、特发性血小板减少性紫癜3例、传染性单核细胞增多症5例、骨髓未见明显异常10例)，其中男13例、女18例，年龄23～59岁。所有病例经临床及实验室检查确诊，且采集标本时未接受任何临床治疗。

二、方法

1.标本采集 髂前或髂后上棘部位进行穿刺抽取骨髓液1 mL，立即置于含有2 mL肝素抗凝剂的生化管中，轻轻上下颠倒摇匀，避免骨髓液凝固，立即送检。

2.仪器与试剂 仪器为FACS-Calibur流式细胞仪(美国BD公司)。白血病免疫分型试剂［CD45-Percp、CD10-异硫氰酸荧光素(FITC)、CD19-藻红蛋白(PE)、CD20-FITC、CD5-PE、CD2-FITC、CD22-PE、CD7-FITC、CD33-PE、CD15-FITC、CD11b-PE、CD34-FITC、CD14-PE、HLA-DR-FITC、CD13-PE、IgG1-FITC/IgG2a-PE;survivin检测抗体Survivin-Alexa Fluor488］由美国BD公司和美国Cell Signaling公司提供的。

3.流式细胞术检测 取100μL骨髓标本，分别加入各荧光标记抗体20μL，充分混匀后室温(15～22℃)避光孵育20 min;再加入10×红细胞裂解液1 mL，混匀后室温(15～22℃)避光8 min，再加入磷酸盐缓冲液(PBS)1 mL，1 000×g离心5 min，弃上清，重复1次;弃上清，加入适量PBS充分混匀，进行流式细胞仪检测。运行FACSComp软件，以BD三色流式细胞仪定标试剂定标，调节电压及补偿于最佳状态，使用CELLQuest软件进行免疫分型及 survivin检测分析。

三、统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行t检验、方差分析和组间多重比较，实验结果以±s表示，检验水准α=0.05，P＜0.05表示差异有统计学意义。表中各组数据多重比较前均进行了单样本的K-S检验和独立样本的t检验，确定各组数据均呈正态分布且具方差齐性(P＜0.01)。

结 果

一、各组survivin+/CD34+双表达分析

AML治疗未缓解组survivin+/CD34+双表达和survivin+/CD34－表达均明显高于AML治疗缓解组和非恶性血液病组(P＜0.01、P＜0.05)，而非恶性血液病组和AML治疗缓解组survivin+/CD34+双表达和survivin+/CD34－表达差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表1、图1。

表1 各组survivin+/CD34+双表达和survivin+/CD34－表达比较(±s)

表1 各组survivin+/CD34+双表达和survivin+/CD34－表达比较(±s)

注:与AML 治疗未缓解组比较，*P＜0.05、＊＊P＜0.01

AML 治疗缓解组 24 4.06±1.41# 14.32±7.53*

图1 各实验组survivin及CD34+表达情况

二、AML治疗未缓解组survivin+/CD34+双表达和survivin+/CD34－表达的分析

AML各亚型间存在抗体表达的差异，特别是AML-M3型白血病特征性的不表达CD34。本研究将这一特点结合survivin的表达及分析数据将AML治疗未缓解组进一步分为survivin+/CD34+双表达较高的A组(22例)、有survivin+/CD34+双表达也有survivin+/CD34－表达的B组以及 survivin+/CD34－表达较高的C组，见图2～4，比较3组间survivin+/CD34表达的差异。C组survivin+/CD34+双表达明显低于A组和B组(P＜0.01、P＜0.05)，而 A 组与B组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。A组survivin+/CD34－表达明显低于B组和C组(P＜0.01)，而 B组和C组之间差异无统计学意义(P＜0.05)。见表2。

图2 survivin+/CD34+双表达较高的A组

图3 survivin+/CD34+双表达和survivin+/CD34－表达的B组

图4 survivin+/CD34－表达的C组

表2 AML治疗未缓解组3亚组间survivin+/CD34+双表达和survivin+/CD34－表达的比较(±s)

表2 AML治疗未缓解组3亚组间survivin+/CD34+双表达和survivin+/CD34－表达的比较(±s)

注:与A 组比较，*P＜0.01，与B 组比较，#P＜0.05

组 54.38±16.88 C 组 8 2.93±3.55*# 57.53±25.10*

讨 论

survivin属于凋亡抑制蛋白(Inhibitorofapoptosis，IAP)家族，具有抑制细胞凋亡、调控细胞周期的作用，广泛表达于人体的各种肿瘤组织中，通过直接或间接抑制caspase通路而发挥抗凋亡的作用。王会等［11］的研究提出survivin的治疗可以有效地杀死肿瘤细胞，并且最大限度地减少对正常细胞的毒性作用，有望成为一种广谱的肿瘤诊断标记物，并可能是抗肿瘤治疗的重要标靶。林凤如等［12］应用逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)检测survivin在急性白血病骨髓细胞中的表达，结果提示survivin表达阳性者明显高于对照组，获得完全缓解率明显低于survivin阴性组，且预后较差。Mori等［13］在对survivin在白血病中表达的研究中发现，在31例AML及16例急性淋巴细胞白血病中，分别有17例及11例阳性表达survivin，其中M3型AML survivin表达水平最低;在慢性髓系白血病的慢性期没有检测到survivin的表达，而在7例急变期的病例中检测到survivin的表达;二甲亚砜、全反式维甲酸、肿瘤坏死因子可下调HL-60细胞的survivin表达水平，故认为survivin与造血细胞的分化及白血病的发生有关。王晔［14］的研究表明survivin和bcl-2协同作用，促进白血病的发生、发展。张岚等［15］通过构建含有人survivin基因的表达质粒并转染K562细胞的研究方法，结果发现急性白血病患者survivin mRNA的表达阳性率高于正常对照组，且其表达量在初发、复发及缓解时都较正常对照高。这些研究都提示survivin表达紊乱可能在急性白血病的发病过程中起重要作用，且有可能成为治疗及预后的指标之一。陈玺等［16］应用蛋白印迹法检测18例白血病患者化疗前和10名正常对照组外周血中单个核细胞survivin蛋白的表达，并与患者的临床特点进行相关性分析，结果发现survivin基因可选择性地在白血病细胞中表达，提示survivin表达与白血病的发生有一定的关系。另外李文琦等［17］的研究也表明在成人(ALL)患者中，survivin的高表达可能造成预后不良。目前国内外关于survivin的研究都是以治疗前的白血病患者与健康人进行对照，以此分析评价白血病患者在未经治疗的疾病状态下其骨髓中survivin基因的表达情况。这样的对照研究只能反映患者一个状态时的状况，而不能动态综合评价这一因素在白血病发生过程中的作用。本研究通过检测在监测期内未转化为恶性血液病的患者和AML患者骨髓细胞中survivin的表达，探讨survivin在非恶性血液病以及AML骨髓细胞中表达的差异情况。同时将AML组分为治疗未缓解组和治疗缓解组，比较AML患者在经治疗未达缓解标准及经治疗达到完全或部分缓解标准时survivin的表达变化情况，以此对survivin在AML发生发展过程中的作用以及对临床治疗预后的影响综合分析。另外本研究选用的流式细胞术较之目前普遍应用的RTPCR法，不仅可以将骨髓细胞上survivin的表达定性，同时可以将这种表达定量分析，也使研究结果更具有说服力。

本研究显示，加入了 survivin检测抗体的AML患者的骨髓流式细胞分析图中，survivin的表达并不只在异常增生的原始细胞中，所有骨髓细胞中都有survivin的表达，提示白血病发病时survivin表达的增多可能抑制了骨髓中所有细胞的正常凋亡，且这种异常表达可能不受白血病分型的影响。AML治疗未缓解组骨髓中survivin的表达均明显高于AML治疗缓解组和非恶性血液病组，提示survivin在骨髓细胞中的表达对白血病治疗效果及预后有可能有预估作用。survivin高表达的AML病例后期经治疗缓解率低或不能缓解，这与survivin的细胞选择性表达的特性一致，表明survivin可能对白血病的发生、发展及预后有影响作用，也与张向峰等［18］的研究结果相类似。本研究中非恶性血液病组survivin的表达明显低于AML治疗未缓解组，而与AML治疗缓解组无明显差异。本研究推测survivin表达偏低时可能可以降低其他血液疾病转化为白血病的风险，提示对survivin的检测可以作为对非恶性血液病转化为白血病风险的预估指标。此外，本研究中共收取非恶性血液病患者34例，其中3例survivin表达较高，且实验期间转化为骨髓增生异常综合征(MDS)或白血病。本研究将survivin表达较低的31例非恶性血液病作为对照组，且在半年多研究期间暂未转化为恶性血液病，是否提示survivin表达的升高有利于细胞逃离生长调控，促进白血病细胞的过度增殖蓄积，从而引发白血病的发生还有待今后大样本量的更加深入的研究。CD34是造血干/祖细胞的特征性标志，近年国外文献报道部分造血系统恶性肿瘤尤其是急性白血病存在早期分化抗原，如CD34、CD90和CD133的异常表达，作为干/祖细胞标志又是重要黏附分子的CD34与急性白血病的发生、发展有密切关系。因此CD34的检测可以使白血病疗效的观察更具有针对性。本研究将CD34+在AML各表型间表达情况不尽相同的特点与survivin的表达对AML的影响作用相结合，把AML初发病例的治疗未缓解组按表达情况进一步分组加以分析。结果显示被检测的AML病例中所有提示有CD34+表达的病例均伴有survivin的表达，但所有提示有survivin表达的AML病例却并不都伴有CD34+的表达。在CD34+不表达或表达较低的AML患者中，survivin基因高表达的患者同样缓解率低或不能缓解。因此可以推断当骨髓细胞中开始出现异常增生的原始细胞时，survivin的过度表达可能比CD34有更显著的病变提示价值。不久的将来通过更多更加深入的研究，survivin将可能成为临床诊断和治疗白血病的新的更为理想的标志物和靶点。

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