骨桥蛋白与炎症分子核因子κB在中耳胆脂瘤上皮组织中的表达及相关性分析*

唐一萍，冯 俊，马 鹏

南充市中心医院·川北医学院第二临床医学院 耳鼻咽喉头颈外科(南充 637000)

中耳胆脂瘤为耳鼻喉科的常见病，其病理特征是中耳腔内有大量高度角化鳞状上皮异常增生，并见邻近组织出现骨质破坏。近年随着临床对中耳胆脂瘤研究不断深入，已有研究[1-3]报道，中耳胆脂瘤出现骨质破坏的机制为炎症细胞因子参与骨质破坏，破骨细胞有骨溶解作用，酶类介导影响骨质吸收作用等。骨桥蛋白(osteoponton,OPN)为分布于细胞外基质中的一种分泌型糖基化磷蛋白，相关文献[4]报道，OPN可增加骨基质与破骨细胞之间的粘附力，使破骨细胞的溶骨活性明显升高，故其在骨质破坏过程中可发挥重要的作用。炎症分子核因子κB(NF-κB)为属于转录因子的一种，其能够通过不同途径促进破骨细胞分化与成熟，进而促使细胞外的骨基质发生降解，引起骨破坏[5]。但在临床报道中关于OPN与NF-κB在中耳胆脂瘤上皮组织中的相关性研究较为少见。鉴于此，本研究通过检测OPN与NF-κB在中耳胆脂瘤上皮组织中的表达情况以及二者的相关性，以期为今后临床诊疗本病提供一定的指导意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2017年9月至2019年1月在南充市中心医院耳鼻咽喉头颈外科行手术治疗的耳胆脂瘤患者30例为试验组，其中男16例，女14例，年龄22～65(36.09±4.22)岁；另选取同期30例非胆脂瘤型中耳炎患者为对照组，其中男18例，女12例，年龄20～65(36.71±3.96)岁，两组年龄、性别等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。手术过程中取两组患者适量中耳腔的病变组织作为标本。采集的标本要求：试验组标本中含有胆脂瘤的上皮组织、皮下结缔组织和囊内容物；对照组标本为鳞状上皮组织。

1.2 实验材料

免疫组化试剂盒(货号： ZKSP-10447)购自深圳子科生物技术有限公司；DAB显色试剂(货号：G1211-1)购自上海生工生物工程有限公司；鼠抗人NF-κB单克隆抗体(货号：kl824Ga21)、鼠抗人OPN单克隆抗体(货号：kl899Bo21)均购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；双目生物显微镜(型号：LDM500)购自德国Leica徕卡公司。

1.3 方法

两组标本取材后将其置于10%中性福尔马林溶液中固定，经石蜡包埋后，制作成厚度为4 μm的连续切片。将石蜡切片进行常规的脱蜡水化，滴加一定量的柠檬酸盐缓冲液在中、高档火微波炉中修复12 min。取出冷却后，加入适量内源性过氧化酶阻断剂，静置10 min后冲洗，并滴加山羊血清，封闭10 min后，甩去血清，滴加一抗(鼠抗人NF-κB单克隆抗体、鼠抗人OPN单克隆抗体)、滴加聚合物增强剂及滴加酶标抗鼠/兔聚合物等操作，并在每孔中注入适量显色液孵育30 min。然后进行苏木素复染、脱水、封片操作，最后在显微镜下观察。与此同时，选择PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，其余操作与前相同。并以同1张切片上的非染色部位为该张切片阳性处的自身对照。每个标本随机抽选3张切片在光镜200倍下选4个不同的视野，并在Meta Morph/DPl0/BX41显微图像分析仪记录，以细胞浆、细胞核内有棕黄色或深棕黄色颗粒判断为阳性，以此为标准自动检测识别所有视野中的阳性结果，以参数积分光密度(IOD)表示蛋白颗粒密度。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 两组OPN、NF-κB表达水平比较

试验组的OPN和NF-κB的阳性表达水平均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.001)(表1)。

表1 两组OPN、NF-κB表达水平比较

2.2 不同胆脂瘤侵袭程度的OPN、NF-κB表达水平比较

根据胆脂瘤的破坏范围以及听小骨骨质破坏情况对其侵袭程度进行分级，其中，Ⅰ级(未见有明显的听小骨骨质破坏)4例，Ⅱ级(见有砧骨破坏)11例，Ⅲ级(见有砧骨、锤骨破坏)9例，Ⅳ级(见有砧骨、锤骨、乙状窦沟骨板、乳突天盖破坏)6例。经比较发现，随胆脂瘤侵袭程度的升高，胆脂瘤上皮组织的OPN、NF-κB阳性表达水平逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2 不同胆脂瘤侵袭程度的OPN、NF-κB表达水平比较

2.3 相关性分析

经Spearman相关系数分析发现，OPN、NF-κB表达水平与胆脂瘤侵袭程度呈正相关性(rOPN=0.924，P<0.001；rNF-κB=0.591，P=0.001)，且OPN与NF-κB表达水平呈正相关(r=0.669，P<0.001)(图1)。

3 讨论

在临床上，中耳胆脂瘤主要的生物学特征为听骨链以及其周边骨质受到破坏。若本病患者未能得到及时、有效治疗会随着病情发展，骨质破坏会损及听骨、面神经管、乳突天盖等而出现面瘫、颅内感染等严重后果。目前，关于中耳胆脂瘤骨质破坏的机制尚无明确的说法，比较趋于一致的观点[6]认为，胆脂瘤上皮组织及其邻近组织分泌的细胞因子在中耳胆脂瘤病变发展过程中起着重要的作用。

3.1 NF-κB与中耳胆脂瘤的关系

从本质上而言，NF-κB属于转录调控因子的一种，起初在B淋巴细胞中被发现，NF-κB也可表达分布于机体软骨细胞中。国外也有研究[7]报道，NF-κB能够通过介导、调控机体免疫应答、炎症因子释放、细胞凋亡等病理过程而参与许多炎症性疾病发生发展。一般情况下，NF-κB是以非活性形式分布于细胞胞浆中，一旦受到外界刺激，病变组织会活化、释放大量NF-κB，与此同时，该因子还可与免疫球蛋白结合，进而参与免疫性炎症的发展进程及转归。Jesic等[8]研究显示，NF-κB能够参与中耳胆脂瘤的发生，可能与上调炎症介质，释放大量细胞因子有关。目前，以NF-κB为分子靶点也成为了临床诊治中耳胆脂瘤的新研究方向，尤其是在中耳胆脂瘤治疗过程中，应用NF-κB活性抑制剂能够在一定程度上发挥抑制骨质破坏的作用[9]。本研究结果也显示，试验组患者病变上皮组织中NF-κB阳性表达率明显高于对照组非胆脂瘤型中耳炎患者，而且NF-κB阳性表达率会随着胆脂瘤侵袭程度加深而增加，表明了NF-κB能够加剧胆脂瘤病情发展。

3.2 OPN与中耳胆脂瘤的关系

OPN是分布于细胞外基质的一种功能性蛋白质，同时也属于早期T淋巴细胞活化因子，能够诱导促炎细胞因子分泌，使骨质破坏程度加重[10]。有动物实验研究[11]发现，OPN能够激活多种趋化因子、促炎因子，介导炎症反应，进而调控听小骨骨质破坏。此外，OPN还可促进骨质发生病理性钙化，加快骨质变性坏死的进程。在本研究中，试验组患者的OPN阳性表达率明显高于对照组，且其阳性表达随病变侵袭程度增加而升高，表明了OPN在中耳胆脂瘤发生发展中起着重要作用，故其可成为胆脂瘤病变严重程度判断、疗效评估、预后预测的主要观察指标。

3.3 OPN、NF-κB与中耳胆脂瘤的关系

当前有研究[12]证实，OPN与NF-κB有着密切的相关性。NF-κB的活化需要以OPN为基质来实现的。体外实验研究[13]也发现，在中耳胆脂瘤实验大鼠中，病变组织的OPN表达水平会随NF-κB的活性增加而提高，但如果预先给予大鼠NF-κB活性抑制剂可发现OPN的表达水平明显减少，故可猜测中耳胆脂瘤病情进展愈OPN、NF-κB表达程度相关，而且两者相互调控。也有研究[14]认为，中耳胆脂瘤病灶中OPN呈异常高表达，其有可能通过NF-κB信号转导途径，刺激机体内炎症介质释放，使细胞因子表达增加，促进骨质破坏。本研究经Spearman相关系数分析发现，OPN、NF-κB表达水平与胆脂瘤侵袭程度呈正相关性(P<0.05)，且OPN与NF-κB表达水平呈正相关(P<0.05)，充分说明了两种物质能够协同参与中耳胆脂瘤骨质破坏的病理进程。

综上所述，OPN、NF-κB在中耳胆脂瘤上皮组织中呈现异常阳性表达，且其阳性表达率会随胆脂瘤上皮组织增殖及骨质破坏的加重而增加，提示OPN有可能通过调节NF-κB的信号转导途径协同参与中耳胆脂瘤的发生发展，其对于判断患者病情严重程度具有一定参考意义。