胰腺癌患者解整合素样金属蛋白酶10与吉西他滨化疗敏感性的关系分析*

黄丽敏，马洪升，董文佳

1.自贡市第四人民医院 消化内科(自贡 643000)；2.四川大学华西医院 消化内科 (成都 610000)

胰腺癌具有较高的死亡率，患者5年存活率<6%，是预后较差的恶性肿瘤之一[1-2]。近年来临床数据[3]显示，胰腺癌由于确诊率不高，患者在确诊后已失去手术治疗的最佳时间，因此化疗成为胰腺癌和目前大多数癌症患者较为有效的治疗方法。吉西他滨为一种新的胞嘧啶核苷衍生物[4]，能够经脱氧胞嘧啶激酶活化后渗入细胞DNA；同时其还能通过抑制核苷酸还原酶活性，降低胞内脱氧核苷三磷酸酯水平，抑制肿瘤生长，临床主要作为胰腺癌晚期患者的二线用药[5-6]。解整合素样金属蛋白酶10(ADAM10)是一种细胞膜结合糖蛋白[7-8]，有研究[9]指出，其在肺癌患者中的表达水平与治疗、预后相关。现阶段关于ADAM10蛋白对肿瘤细胞化疗药物的敏感性研究尚无报道，本研究探讨了ADAM10蛋白对肿瘤细胞化疗药物的敏感性。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2015年1月至2017年1月四川大学华西医院经病理学检查确诊的79例胰腺癌患者为研究对象。纳入标准：1)患者经病理学、影像学首次确诊为胰腺癌患者；2)入院治疗前未接受放疗、化疗、手术、靶向药物等治疗；3)患者同意接受吉西他滨化疗，治疗前均存在可测量病灶；4)临床资料完整，治疗依从性良好；5)身体状况相对良好，预计存活期>1年。排除标准：1)患者存在明显的肿瘤转移或合并有其他肿瘤；2)合并有肝肾功能异常；3)患有严重心血管疾病；4)妊娠期或哺乳期妇女；5)存在用药过敏、治疗不耐受或禁忌症的患者。本研究经医院伦理委员会通过后，患者均签署知情同意书。

1.2 材料与方法

1.2.1 试剂及仪器 兔抗人ADAM10抗体购自美国Proteintech Group公司，货号：25900-1-AP；HRP标记的羊抗兔IgG抗体购自中国碧云天生物公司，货号：A0208；图像采集成像系统(chemiDocTm)及图像分析系统(Quantity One 1-D 分析软件)购自美国Bio-Rad 公司。

1.2.2 样本选取 所有入选患者住院后依照检测要求进行胰腺穿刺超声定位，签署知情同意书，胰腺组织标本长度1.5～2.0 cm，会管区数量不小于3个，标本经10%多聚甲醛固定，石蜡包埋，制备成组织切片。

1.2.3 免疫组化分析 将患者肿瘤组织经石蜡切片后,固定于载玻片上，50 ℃烘箱中烘1 h后，二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇及75%乙醇依次进行水化，蒸馏水洗涤3次，然后置于柠檬酸钠溶液中加热2次， 8 min/次，自然冷却，PBS洗涤2次。3% H2O2溶液中浸10 min，阻断内源性过氧化物酶活性，PBS洗涤3次后，滴加ADAM10抗体稀释液，4 ℃孵育过夜。PBS洗涤3次后用羊抗兔二抗室温孵育1 h，PBS洗涤3次，DAB染色，苏木精复染，0.1% HCl分化，蓝化，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.2.4 数据对比分析 分别统计完全缓解(complete response,CR)：所有靶病灶消失，无新病灶出现，且肿瘤标志物正常，至少维持4周；部分缓解(partial response, PR)：靶病灶最大径之和减少≥30%，至少维持4周；疾病稳定(stable disease,SD)：靶病灶最大径之和缩小未达PR，或增大未达疾病进展(progressive disease, PD)和PD靶病灶最大径之和至少增加≥20%，或出现新病灶的人数。结果评估由两名专业病理人员采用双盲法进行，随机选取5个视野区，独立进行半定量积分判断，结果一致则记录结果，结果不一致则由第3位更加权威的医师确定。显微镜下观察组织细胞，细胞质中出现黄色或棕色颗粒为显色。评分准则[10]：1)按染色面积分为：染色细胞比例< 5%记0分；染色细胞比例5%～30%记1分；染色细胞比例为 31%～75%记2分；染色细胞比例>75%记3分。2)依照染色深浅分为：无色0分；微弱1分；中度2分；强染色3分；染色得分≥1分定义为阳性。最终得分=染色面积得分×染色深浅得分，>4分定义为阳性高表达。

1.2.5 化疗方案 吉西他滨 1 000 mg/m2、1次/d，静脉注射1个疗程7周，停止治疗1周；后3个疗程用药3周，4周为1个疗程，一共治疗4个疗程。

1.2.6 随访 所有患者定期随访，包括患者治疗方案、复查信息、电子计算机断层扫描(computed tomography，CT)、血管造影或腹腔镜检、生存、复发等信息统计。时间起始于患者入院治疗，随访8～24(18.67±1.67)月，统计不良事件发生情况。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 患者一般资料分析

分析患者的临床病理特征与胰腺癌组织中ADAM10表达蛋白表达水平，结果显示，胰腺癌高表组和胰腺癌低表达组中分化等级、浸润分期、淋巴结转移、TNM分期差异有统计学意义(P<0.05)；与患者的年龄、性别、肿瘤发生位置差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 ADAM10表达与患者一般资料分析[n(%)]

2.2 免疫组织化学染色分析

高表达组可以看出较多细胞被染成深蓝色，间质为深棕色；低表达组少量细胞被染色为蓝色，间质少量被染色为棕色，阴性组无明显被染色情况；ADAM10表达的总阳性率为98.73%(78/79)，其中高表达占65.82%(52/79)，低表达32.91%(26/79)，阴性表达占1.27%(1/79)(图1)。

2.3 ADAM10表达与患者化疗效果分析

ADAM10阳性高表达组患者CR和PR人数比例低于ADAM10低表达组，差异有统计学意义(P<0.05)；ADAM10阳性高表达组患者SD和PD人数比例高于ADAM10低表达组，差异有统计学意义(P<0.05)；ADAM10阳性高表达组患者治疗总有效率为42.31%，明显低于ADAM10低表达组患者66.67%(P<0.05)(表2)。

表2 ADAM10表达与患者化疗效果分析[n(%)]

2.4 ADAM10表达与吉西他滨化疗敏感相关性分析

ADAM10表达与胰腺癌吉西他滨化疗敏感性呈负相关(r=-0.457，P<0.001)。

2.5 ADAM10表达与胰腺癌患者生存分析

所有患者在入院治疗两年里均做到有效随访，ADAM10蛋白高表达组患者两年里中位生存时间、无病生存率、总生存率均低于ADAM10蛋白低表达组，差异有统计学意义(P<0.05)(图2、表3)。

表3 ADAM10表达与胰腺癌患者生存分析[n(%)]

2.6 胰腺癌组织HE染色结果

胰腺癌组织高表达组有明显的炎性因子浸润，低表达组细胞分布较为均匀且无炎性因子的浸润(图3)。

3 讨论

ADAM蛋白是一类成员较多的家族蛋白，迄今已报道的ADAM蛋白达30多种，其功能主要涉及细胞的粘附、融合、迁移及细胞膜蛋白的降解及脱落，参与调控细胞的多种生物学功能。ADAM10是ADAM家族蛋白中的一员，研究[11]显示，其可调控依赖钙黏蛋白的内皮细胞功能及细胞的迁移，主要是调节膜内蛋白水解作用发挥其生理功能。由于ADAM10蛋白是跨膜蛋白，胞外肽段存在于细胞间隙，能够参与细胞间的信号转导，而胞内肽段可以作为一种分子，调节相关基因表达，启动细胞内一些列的生理生化反应，如调控细胞的生长、粘附等[12]。在对ADAM家族其他蛋白如ADAM8、ADAM17等的研究[13-14]发现，蛋白表达水平在肿瘤的发生和发展过程中起着重要作用。在对ADAM17的蛋白表达研究[15]显示，其蛋白表达水平与肿瘤的耐药性有关。以上研究提示，ADAM10蛋白的表达水平可能也参与肿瘤的发生、发展及耐药过程，而目前关于ADAM10蛋白表达与肿瘤耐药性的研究尚无报道，因此本研究主要探讨ADAM10蛋白的表达与胰腺癌患者吉西他滨化疗敏感性的研究。

本研究发现胰腺癌组织中ADAM10蛋白总阳性表达率达98.73%，这提示ADAM10表达可以作为胰腺癌诊断的生物标志物。欧晔等[16]、郑佳等[17]对肿瘤患者血清中的ADAM10的表达研究也证实，ADAM10异常高表达可作为肿瘤诊断的参考。本研究发现，ADAM10蛋白表达与胰腺癌患者的分化等级、浸润分期、淋巴结转移、TNM分期有关，与刘传文等[18]研究结果一致，ADAM10蛋白表达参于调控肿瘤细胞的生长、粘附[19]。

本研究发现，ADAM10表达与肿瘤进展呈负相关(r=-0.457，P<0.001)，这表明ADAM10高表达能够降低胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性，使化疗有效率降低；可能是由于ADAM10蛋白的高表达降低细胞膜表面其他跨膜蛋白的数量和功能，降低细胞对外界物质的摄取能力，与李晨[20]、段志辉[21]的研究结果一致。本研究发现，ADAM10蛋白表达对两年内的中位生存时间、无病生存率、总生存率有影响，关艳等[22]研究也证实ADAM10蛋白预示患者存在较差预后。

综上所述，ADAM10蛋白表达水平与吉西他滨化疗敏感性呈负相关。但本研究未能对其具体的作用机制深入研究，后续将进一步深入研究。