不同成份脱钙液对骨组织脱钙效果的比较*

祁宏枝，罗添友，唐 涛

1. 成都中医药大学附属四川省八一康复中心 病理科(成都 611135)；2.四川大学华西医院 病理科(成都 610041)；3. 成都中医药大学附属四川省八一康复中心 骨科(成都 611135)

骨组织由细胞、基质和纤维成份构成，其中基质含有大量的固体无机盐，主要成份为羟基磷灰石结晶，所以骨组织质地较硬，在病理技术中难以制成切片，从而影响临床诊断，因此在病理切片前必须对其脱钙处理[1]。目前病理科常用的脱钙液是复合酸类脱钙液，是将不同种类酸类按比例与中性福尔马林液配伍使用，从而将骨组织中难溶于水的碳酸钙和磷酸钙转化为易溶于水的钙盐和磷酸盐等，达到软化和固定标本的目的[2-3]。目前临床上配制的脱钙液种类繁多，在软化和固定标本时均有各自的优缺点。本研究拟比较3种不同成份的脱钙液对股骨头组织进行脱钙固定的效果，为临床病理技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2018年5—10月在四川省八一康复中心手术室送检的股骨头标本20例为研究对象。

1.2 仪器

RF-2A电动组织取材刀购自西安瑞丰仪器设备有限责任公司，ES全自动脱水机、石蜡包埋机、ME+全自动石蜡切片机、全自动染色机及全自动胶片封片机均购自美国珊顿赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 试剂

苏木精购自上海国药集团化学试剂有限公司、无水乙醇购自成都金山化学试剂有限公司；硫酸铝钾、碘酸钠均购自成都市联合化工试剂研究所；醇溶性伊红购自成都市科龙化工试剂厂；10%中性福尔马林、浓盐酸及硝酸均购自成都市科隆化学品有限公司；免疫组化试剂：一抗S-100、CD68、Ki-67、二抗、DAB显色液均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；柠檬酸抗原修复液、PBS液均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.4 试剂配制

1.4.1 Gill苏木精改良配置 Ⅰ液：苏木精1 g溶于50 mL无水乙醇；Ⅱ液：硫酸铝钾4 g完全溶于150 mL蒸馏水；Ⅰ、Ⅱ混合后，加入100 mg碘酸钠，最后加入3 mL冰乙酸。

1.4.2 脱钙液配制 1)甲液：硝酸10 mL加入10%中性福尔马林90 mL，配制成10%硝酸甲醛液；2)乙液：盐酸30 mL加入10%中性福尔马林70 mL，配制成30%盐酸甲醛液；3)丙液：盐酸30 mL+甲酸30 mL加入10%中性福尔马林40 mL，配制成30%盐酸甲酸甲醛液。

1.5 方法

1.5.1 脱钙方法 首先将新鲜离体股骨头组织用10%中性福尔马林及时固定24 h，每例股骨头分别取9块，制成大小约1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm标本，每个标本分别做好标记。所有骨组织均分成3份，每份3块，3份骨组织成分大致相当，分别放入甲、乙、丙3种新鲜脱钙液中(每瓶脱钙液为100～200 mL)，在室温下进行脱钙并记录脱钙时间。

1.5.2 脱钙后标本处理 标本检查以手感有弹性、用大头针能轻松刺入为脱钙良好，所有标本脱钙后均放人自来水中反复冲洗30 min，再放入全自动脱水机中进一步脱水处理，次日进行石蜡包埋，切片厚度为2～4 μm，行常规HE染色，全自动封片机封片后镜下观察。

1.5.3 免疫组化染色 进行常规免疫组化染色：采用Envision法染色， 选取9例C组股骨头组织切片，70 ℃烤片40 min(防脱载玻片)，脱蜡后放入3%H2O2处理15 min，pH 6.0的柠檬酸抗原修复液高压锅修复3 min。再随机分成3份，分别滴加一抗S-100、CD68和Ki67，4～8 ℃过夜，PBS液冲洗2次，滴加二抗，37 ℃孵育60 min， DAB显色，苏木精复染细胞核，脱水、透明、封片、观察、拍照。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 3组骨组织脱钙时间比较

3组骨组织脱钙时间比较，差异有统计学意义(F=281.577,P<0.05)。与甲组比较，乙组和丙组脱钙时间明显缩短(P<0.05)，且丙组脱钙时间比乙组短(P<0.05)(表1)。

表1 3种脱钙液脱钙时间的比较

注：与甲组比较，*P<0.05；与乙组比较，#P<0.05

2.2 3组骨组织的酸化程度比较

根据骨组织表面颜色判断其酸化程度。股骨头组织经3种脱钙液浸泡24 h后，骨组织的表面呈腊黄色，每组出现腊黄色的时间依次为丙组<乙组<甲组，且浸泡时间越长，发黄现象越明显。

2.3 3组骨组织的切片效果比较

经3种脱钙液脱钙后所有股骨头组织均能完整切片，但经甲液酸化后的骨组织切片质量较差，沙粒掉落现象明显，肉眼能看见明显的切片痕迹；经乙液酸化后的骨组织切片质量较好，偶有沙粒存在，在低倍显微镜下能看见明显的切片痕迹；经丙液酸化后的骨组织切片质量佳，切片时组织松软，无沙粒感，在低倍显微镜下未看见切片痕迹。

2.4 骨组织HE染色效果比较

经甲液和乙液酸化脱钙后，镜下可见明显的切片痕迹，密质骨区域切片不连续，厚薄分布不均。经甲液脱钙、切片和HE染色后，细胞核染色不均匀，部分核结构不清，染色不均一，局部颜色深，染色质部分模糊不清；经乙液处理后通过HE染色，染色质结构较清晰，核呈紫蓝色，核质对比度明显；经丙液处理后通过HE染色，股骨头骨组织镜下结构平整，骨板清晰可见，细胞核呈紫蓝色，与细胞质对比鲜明(图1)。

2.5 股骨头组织经C液处理后免疫组化染色分析

经丙脱钙液处理后，S-100、CD68、Ki67在骨髓中的表达清楚可见，经S-100染色后，髓腔中脂肪细胞阳性，脂肪细胞边缘存在非特异性染色，中间散布实心结构，聚集成圆形的束状，其中分布数个细胞核；经CD68染色后 髓腔中组织细胞显示胞浆阳性；经Ki-67染色髓腔中造血细胞灶性阳性(图2)。

3 讨论

本研究参照吴鸿雁等[4]研究并结合临床病理技术，使用10%硝酸甲醛液作对照，是因为14%～20%的硝酸液对骨组织溶解较明显，且对脱钙时间及脱钙程度不易掌控，因此本研究中选用10%的硝酸甲醛液作对照。

脱钙是骨组织石蜡切片制备中的重要环节，临床上常根据钙盐溶解度不同采用加酸法将钙盐与胶原纤维分离[5-6]，不同的配制液对钙盐的溶解系数不同，对钙盐的溶解效果和胶原纤维分离程度也不一样，因此需要优化脱钙液的配方来达到快速有效的脱钙，同时对骨组织细胞破坏相对较少的目的。

本研究通过对20例股骨头组织分别在10%硝酸甲醛液、30%盐酸甲醛液及30%盐酸甲酸甲醛液中脱钙，可以看出，3种脱钙液都能脱钙，但从脱钙时间来比较依次递减，10%硝酸甲醛液所用时间长达5 d左右才能完成；30%盐酸甲醛液需要3 d左右，而30%盐酸甲酸甲醛液所用时间短，一般在24～36 h可达到满意的脱钙效果。

从HE染色后切片的质量来看，经30%盐酸甲酸甲醛液处理切片质量好，股骨头骨组织镜下结构平整，骨板清晰，细胞核呈紫蓝色，与细胞质对比鲜明；而10%硝酸甲醛脱钙液处理后切片质量较差，细胞核染色欠均匀，部分细胞核结构不清及染色质模糊。究其原因，10%硝酸甲醛液酸性较弱，溶解钙盐能力较差，脱钙不彻底造成，且硝酸在溶解钙盐过程中会产生NO2和CO2气泡，使局部组织结构会受到破坏，甲酸属于弱酸，产生CO2气泡速度较慢，且容易溶解于液体中[7]。10%中性福尔马林是标本组织常用的固定液，对组织渗透力强、收缩小，能使大多数组织保存较好，加入盐酸后配制成盐酸甲醛液，对骨组织固定的同时又能起脱钙的作用，从而缩短了组织的固定及前期处理时间[8]；在盐酸甲醛液中加入甲酸后，进一步提升了脱钙液的酸化能力，脱钙时间明显较盐酸甲醛液缩短，且在HE染色中对细胞核染色结果较好[9]。

另一方面，经30%盐酸甲酸甲醛液中脱钙的股骨头标本，从免疫组化染色效果的效果来看，S-100、CD68及Ki67在骨髓中的表达特异性明显，经S-100染色后髓腔中脂肪细胞呈阳性，可清楚看见细胞核团；经CD68染色后股骨头 髓腔中组织细胞显示胞浆阳性；经Ki67染色骨髓腔中造血细胞灶性阳性，这对股骨头坏死或骨肿瘤病例的病理诊断提供了可靠的病理技术支持[10]。

综上所述，30%盐酸甲酸甲醛液能缩短股骨头组织的脱钙时间，增强了HE染色及免疫组化染色的效果。