重度子痫前期人胎盘绒毛膜板动脉中钙激活氯离子通道的表达情况

兰秋丽，傅晓冬

西南医科大学附属医院 产科(泸州 646000)

妊娠期高血压疾病(hypertensive disorder complicating pregnancy,HDCP)是一类妊娠与血压升高并存且严重影响母儿健康的疾病,可造成多器官和系统损害，导致不良妊娠结局。钙激活氯离子通道(Calcium-activated chloride channels,CaCCs)是一类分布于细胞膜，由细胞内钙离子激活而转运阴离子的离子通道，2008年研究[1]揭示，跨膜蛋白16A(transmembrane protein 16A，TMEM16A)乃该通道分子基础,有研究[2-3]发现，多部位的动脉平滑肌、血管内皮细胞中均有表达，在调节血管收缩和血管张力中具有重要作用。本研究通过比较TMEM16A在正常妊娠与重度子痫前期不同类型患者的胎盘绒毛膜板动脉中的表达差异情况，探究该通道与妊娠期高血压疾病之间的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2018年11月至2019年6月于西南医科大学附属医院产科分娩的50例孕妇作为研究对象。其中正常孕妇20例作为对照组(normal control，NC)，重度子痫前期20例作为重度孕痫前期组(severe preeclampsia,SPE)；早发型重度子痫前期(early-onsetsevere preeclampsia,ESPE)及晚发型重度子痫前期(late-onset severe preeclampsia,LSPE)各15例成组进行比较；重度子痫前期诊断标准参考人民卫生出版社第九版妇产科学[6]，其中发病孕周<34周诊断为早发型重度子痫前期，>34周诊断为晚发型重度子痫前期，均不伴胎儿生长受限。纳入标准：22～45岁育龄期妇女；单胎妊娠；根据早孕超声核实孕周，孕周准确。排除标准：妊娠期糖尿病、妊娠期肝内胆汁淤积、妊娠合并心脏病等妊娠相关疾病。本研究获西南医科大学附属医院伦理审批，标本取材前与患者及家属沟通并签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集 按上述标准选取的研究对象，无论经阴道分娩或剖宫产分娩，无论自然临产抑或病情需要终止妊娠，在胎盘娩出后尽快辨认胎盘膜板动脉分支，锐性取下标本放入标本箱中立即运回实验室，在冰上钝锐性分离膜板动脉表面系膜及其他组织，在无菌水中漂洗干净后放入无菌EP管中，做好标记放入-80 ℃冰箱。

1.2.2 主要试剂、仪器及耗材 总RNA提取试剂盒，QuantiNova SYBR Green PCR Kit，2×Taq PCR MasterMix(TIANGEN, China)，Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix，TMEM16A及β-actin基因上下游引物由上海Sangon Biotech合成，RIPA 裂解液，BCA蛋白定量试剂盒,蛋白酶抑制剂PMSF，SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)；β-actinmonoclonal antibody,Recombinnant Anti-TMEM16A antibody(SP31)，Goat anti-Rabbit Secondary Antibody。核酸浓度检测仪，凝胶成像系统，实时荧光定量PCR系统，蛋白电泳-转膜系统，一体式化学发光成像仪。

1.2.3 实时荧光定量PCR主要步骤 在液氮的低温维持下将标本研磨成粉末状，取80 mg与裂解液1 mL分装在无菌EP管中充分裂解，然后按分离、沉淀、洗涤、溶解的步骤提取RNA,并加入配置好的琼脂糖凝胶后电泳，再用凝胶成像系统成像观察其完整度；完整度较好的通过RNA光谱分析系统测定浓度，据浓度将RNA逆转录成cDNA,选取β-actin作为内参基因，通过QPCR系统测定目的基因TMEM16A mRNA相对表达量。

1.2.4 蛋白质印迹技术主要步骤 在液氮的低温维持下将标本研磨成粉末，取100 mg与RIPA蛋白裂解液(含蛋白酶抑制剂PMSF)1 mL分装在无菌EP管中充分裂解，再用超声破碎仪裂解细胞，取上清液加蛋白上样缓冲液，加热使蛋白变性后置于-20 ℃低温中保存，经过配胶、加样、电泳、转膜(内参的分子量为43 kDa,TMEM16A的分子量为114 kDa)、封闭、过夜孵育一抗(内参一抗稀释比例为1∶2 000，TMEM16A一抗稀释比例为1∶2 000)，PBST洗膜后孵育二抗2 h(内参一抗稀释比例为1∶5 000， TMEM16A一抗稀释比例为1∶5 000)，洗膜后置加发光液，于成像仪中成像后测定灰度值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 一般资料比较

NC组与SPE组血压比较，差异有统计学意义(P<0.05)；分娩孕周、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)；ESPE组与LSPE组分娩孕周比较，差异有统计学意义(P<0.05)；年龄、血压比较，差异无统计学意义(P>0.05)(表1～2)。

表1 NC组、SPE组的基本资料比较

表2 ESPE组、LSPE组的基本资料的比较

2.2 NC、SPE组及ESPE、LSPE组中TMEM16A mRNA的相对定量水平比较

NC组△CT值水平为(15.15±0.81)，SPE组△CT值水平为(13.86±0.54)，2-ΔΔCt值水平为(2.50±0.50)，SPE组胎盘模板动脉上TMEM16A mRNA的表达水平是正常组的(2.50±0.50)倍，二者差异有统计学有意义(P<0.05)，即ESPE组△CT值水平为(14.11±0.70)，2-ΔΔCt值水平为(2.22±0.41)，LSPE组△CT值水平为(12.99±0.46)，LSPE组TMEM16A mRNA的表达水平是ESPE组的(2.22±0.41)倍，二者差异有统计学意义(P<0.05)(表3～4)。

类别ΔCt值2-ΔΔCt 值NC组15.15±0.81-SPE组13.86±0.542.50±0.50t5.939P<0.001

类别ΔCt值2-ΔΔCt 值ESPE组14.11±0.70-LSPE组12.99±0.462.22±0.41t5.218P<0.001

2.3 NC、SPE组及ESPE、LSPE组中TMEM16A蛋白的表达情况

NC组和SPE组灰度值比值经Levene′s方差齐性检验提示方差不齐，采用两独立样本的t′检验进行分析，在NC组中TMEM16A的蛋白灰度值比值为(0.28±0.07)，在SPE组中的蛋白灰度值比值为(0.62±0.25)，二者差异有统计学意义(t′=-4.186，P=0.002)；ESPE组和LSPE组灰度值比值经Levene′s方差齐性检验提示方差齐，采用两独立样本的t检验进行分析，在ESPE组中蛋白灰度值比值为(0.47±0.18)，在LSPE组中蛋白灰度值比值(0.75±0.29)，二者差异有统计学意义(t=-2.524，P=0.021)(图1)。

3 讨论

HDCP是一种多因素、多通路及多机制诱发的疾病，在全身小血管痉挛和血管内皮损伤的基础上出现全身多器官和系统损害[4-6]，病情多复杂、变化快，多可导致不良妊娠结局，目前针对发病机制的研究中“两阶段”学说被大部分学者认同[5]，包括子宫螺旋动脉滋养细胞重铸不足，胎盘浅着床导致缺血、缺氧，释放胎盘因子；胎盘因子进入母体血液循环，促使炎症免疫过度激活及血管内皮损伤两个阶段，诱发血管痉挛、血压升高等高血压的一系列变化。胎盘血管不受神经支配[7]，其血管紧张度的调节受血液供应所带离子或分子的控制[8]，在血管的平滑肌细胞和内皮细胞上作用的离子通道是细胞内外离子交换保持稳态的重要通道，若表达和功能发生异常会导致细胞内外离子失衡，同时引起血管张力紊乱，成为各种血管性疾病的病理性生理基础，尽管妊娠期高血压疾病与高血压发病机制不尽相同，但HDCP仍属血管性疾病，故在对HDCP发病机制的研究中，对通道的研究较广泛，其中主要包括钾通道、氯离子通道、水通道及瞬时受体电位通道[9]，目前钾通道研究最多、最全面的通道，而氯离子通道与HDCP的相关研究极少，有研究[10]提示，在心血管系统中主动脉至毛细血管均有TMEM16A表达，其在血压和外周阻力的调控中发挥重要作用。近年TMEM16A在女性生殖系统中的分布和作用的逐渐被揭示[11-13]，如参与子宫平滑肌的收缩、妇科肿瘤的发生、卵巢激素的产生、受精着床等过程，通过对该通道的研究拓展对相关疾病认知及治疗具有一定价值，如通过TMEM16A在正常妊娠及HDCP不同类型中的表达情况探究两者的相关性，为HDCP发病机制的完善奠定理论基础。

氯离子是人体内主要阴离子，而介导氯离子转运的氯离子通道广泛存在于人体内，血管平滑肌上主要有钙激活氯离子通道、容量敏感性氯离子通道和钙依赖性氯离子通道3类氯离子通道，近年钙激活氯离子通道在调控血管收缩方面作用逐渐被揭示，成为药物精准靶向治疗肺动脉高压、高血压、肿瘤等相关疾病的研究热点，CaCCs受电压和钙离子浓度双重调节[14]，表现为若细胞内游离Ca2+浓度升高则可诱发通道开放，研究[15]证实，HDCP患者血浆钙离子浓度减低，细胞内钙离子浓度明显升高，由此可推测，在HDCP患者的血管平滑肌上该特点可诱发钙激活氯离子通道充分开放产生瞬时的内向电流，导致平滑细胞节律性收缩增强，参与外周阻力及血压的调节。研究[16]表明，TMEM16A 通道会产生Cl--Ca2+电流，且激活会导致血管和非血管平滑肌中的膜去极化和收缩。自TMEM16A被确认为CaCCs的基础分子以来，有研究[17]证实，TMEM16A在高血压模型中显著上调，2015年唐巧云[18]提出，TMEM16A具有双重作用 ，既是高血压发生的致病机制，又具有保护因子的作用，如在原发性高血压中TMEM16A与血压呈正相关，而在肾性高血压中则相反[19]。研究[18]表明，TMEM16A的上调可促进基底细胞增殖，过度表达则抑制细胞增殖，起保护作用，在TMEM16A的缺如情况下，血管对促收缩介质不敏感。但仍有研究[20]结果与此相反，认为高血压的肠系膜动脉中TMEM16A的表达下调，并表示与中山大学在第九届全国心血管药理学术会议中的一项研究[21]相同，即TMEM16A可能是通过下调表达来限制血压继续升高来发挥保护作用，也可能是长期高血压状态下发生了结构变化。赵美平等[22]研究中还提出，低氧或缺氧状态会导致TMEM16A高表达而促进血管平滑肌的增殖和重建，而血管平滑肌的增殖会造成血管收缩增加，与HDCP胎盘缺血缺氧的理论相似，由此推测TMEM16A可能参与HDCP的发生发展。

20世纪80年代由于早发型子痫前期对母婴健康的严重影响，引起欧美围产医学界高度重视，诊断以HDCP的发病孕周为主，但临床表现及危害程度与晚发型的差异大，因此有学者推测早发型及晚发型子痫前期可能是HDCP的两种亚型。早发型性子痫前期临床表现为“胎盘源性”疾病特点，即母体及胎儿双方致病，甚至可导致妊娠终止后母婴的远期不良预后，而晚发型则表现为“母源性”疾病特点，以对母体的影响为主，对胎儿危害相对较小。本研究结果表明，HDCP患者的胎盘膜板动脉中TMEM16A的表达明显高于正常组，但在重度子痫前期中晚发型明显高于早发型，与预想趋势相悖，结合唐巧云[18]、郭书红[20]及张政等[21]的研究中提出的TMEM16A在血压调控中可能具有双重作用，可通过下调来限制血管过分收缩，起保护因子的作用，由此推测，TMEM16A可能因受到负反馈调节以同样机制在早发型子痫前期患者中起保护作用，抑或高浓度钙离子的过度刺激导致TMEM16A发生了结构或功能的变化等。目前TMEM16A参与血管性疾病发病机制研究尚不全面，范围局限在动物模型或局部探索的基础上，仍有许多问题待解决，如若该通道具有双重作用，那么过度表达的范围如何界定，激发TMEM16A成为保护因子的条件等均需进一步研究。

综上所述，TMEM16A在重度子痫前期组中的表达明显上调，但重度子痫前期晚发型表达高于早发型，表明此通道与HDCP具有相关性，但其参与HDCP发生的机制尚不清楚，需进一步探究，如通过干预HDCP高风险患者TMEM16A的表达可否改变疾病的发展方向，脐带血管的表达情况与妊娠结局的关系；可通过血管环、妊娠高血压模型等进一步研究两者的因果关系，明确钙激活氯离子通道参与HDCP的机制，为完善HDCP发病机制学说及药物靶向治疗提供新的途径。