SDF-1基因修饰的真皮多能干细胞移植修复脊髓损伤*

鲍全伟，宗兆文,，杨家治，叶 钊，吕明锐，谭 丹△

1.陆军军医大学新桥医院 急诊科(重庆 400037)；2.陆军军医大学 卫勤训练基地战救技能培训教研室(重庆 400038)

脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是创伤中较为严重的损伤，常伴有较为严重的神经功能障碍，严重影响患者的功能恢复。目前，对于SCI尚无有效的治疗方案，干细胞移植被认为是修复SCI功能损伤最有前景的方法之一[1-2]。研究[3]证实，脊髓中存在神经干细胞(neural stem cells, NSCs)，并可参与SCI修复。如何增强内源性NSCs的修复功能，成为SCI修复的策略之一。基质源性因子-1(stromal-derived factor-1, SDF-1)可刺激NSCs迁移，显示出良好的运用前景[3]，但如何局部高效运用尚缺乏有效手段。本研究拟探讨SDF-1基因修饰的大鼠真皮多能干细胞(dermal multipotent stem cells, dMSCs)移植后对SCI修复的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar大鼠购自陆军军医大学动物中心[合格证号：SCXK(渝)20170004]，动物实验、尸体处理按照陆军军医大学动物伦理委员会(执行标准SYXK军2002032)标准实施。

1.2 主要试剂

pAdEasy腺病毒表达载体构建系统由本校解剖教研室董世武博士馈赠，Tripure和DOTAP脂质转染试剂盒购自瑞士Roche公司。细胞培养用培养基、培养瓶、血清等购自美国Hyclone公司。Transwell细胞培养小室购自美国Costar公司，3H-TdR购自中国科学院上海原子核研究所。兔抗SDF-1一抗、藻红蛋白(phycoerythrin, PE)和异硫氰酸荧光素(fluoresceine isothiocyanate, FITC)结合的二抗均购自美国Santa-Cruz公司。维甲酸、地塞米松、IBMX、胰岛素、吲哚美辛购自美国Sigma-Aldrich公司，免疫组化试剂盒购自美国Boster公司。SDF-1 ELISA试剂盒购自德国Phoenix公司。

1.3 大鼠dMSCs的分离培养

采用前期建立的早期贴壁法分离dMSCs[4]。新生1 d Wistar大鼠，引颈处死，酒精消毒，剪取皮肤置于0.25%胰酶消化过夜。次日，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)清洗后，去除表皮和皮下组织，将真皮组织剪成细胞碎片并吹打成细胞悬液，过滤后接种于培养瓶中。6 h后，弃培养液和悬浮细胞，继续培养早期贴壁细胞。反复传代至有集落样细胞群体生成，按常规方法接种和选取细胞克隆，传代备用。

1.4 Adv-SDF-1的构建

采用前期建立的方法使用pAdEasy腺病毒表达载体系统构建Adv-SDF-1[4]。Tripure提取大鼠骨髓的总RNA，扩增SDF-1的全长cDNA，然后亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中，再与pAdEasy-1质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组产生含有SDF-1的骨架质粒。将验证正确的骨架质粒用PacⅠ酶切后转染293 细胞，从而包装出Adv-SDF-1。然后大量扩增，空斑实验测定病毒滴度后备用。

1.5 Adv-SDF-1感染dMSCs

向dMSCs 培养基中加入0.2 mL Adv-SDF-1病毒原液，病毒滴度约为2.0×1010PFU/mL，其中PFU为空斑形成单位(plaque-formating unit，PFU)。继续培养12 h后，采用免疫荧光组织化学检测SDF-1的表达。加入95%乙醇固定细胞20 min，PBS漂洗加入兔抗SDF-1，4 ℃孵育过夜，PBS漂洗，加入PE结合的荧光二抗，室温孵育约30 min，PBS，漂洗，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamino-2-phenyl indole, DAPI)复染细胞核，荧光显微镜下观察。此外，按照SDF-1 ELISA试剂盒的说明检测培养基中SDF-1浓度。

1.6 制备SCI模型及分组

采用改良Allen 重物打击法制作SCI模型[5]。将麻醉的大鼠俯卧位固定后显露T10节段的脊髓，用重20 g、打击头直径为2.5 mm的打击器自2.5 cm高度自由落下，造成T10节段脊髓打击伤。将损伤后的成年大鼠36只随机分为Adv-SDF-1感染dMSCs移植组(A组)，未感染dMSCs移植组(B组)，生理盐水注射组(C组)，每组12只。收集Adv-SDF-1感染和未感染的dMSCs，将密度调整为1×107个/mL，A组大鼠用Hamilton注射器于损伤脊髓上、下各1 mm处注射100 μL Adv-SDF-1感染dMSCs，并保留注射器3 min防止细胞外漏；B组大鼠注射100 μL 未感染的dMSCs；C组大鼠注射100 μL生理盐水。其中，病毒感染dMSCs的步骤同1.5。为防止膀胱感染，术后每日行人工挤压膀胱排尿2 次。SCI 3、7 d后，取损伤处脊髓取材后4%甲醛固定，免疫荧光组织化学检测损伤脊髓中央导水管及其附近的脊髓组织dMSCs的成活及分化情况，Nestin阳性细胞的分布情况。

1.7 行为学检测

SCI 7 d后参照Ferguson等[6]Basso Beattie Bresnahan(BBB)评分法评定大鼠的功能恢复情况。观察SCI大鼠早、中、晚期的后肢运动评分，总共分为21个等级，后肢全瘫为0分，完全正常为21分。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 Adv-SDF-1的构建及其感染dMSCs后SDF-1表达的变化

因SDF-1在大鼠骨髓中高水平表达，故选择从大鼠骨髓中提取RNA扩增SDF-1，然后用pAd Easy腺病毒表达载体系统成功构建了Adv-SDF-1。用其感染dMSCs后，可见dMSCs呈现绿色荧光，而细胞形态未发生明显改变(图1A)。免疫荧光组织化学检测可发现，Adv-SDF-1感染dMSCs后几乎所有细胞均为SDF-1阳性(红色荧光)，阳性细胞数量多于没有感染的dMSCs(图1B、C)。而酶联免疫吸附测试结果显示，感染病毒载体的dMSCS培养基中SDF-1的浓度为(23.8±0.58) μg/L，明显高于对照的(1.35±0.23 ) μg/L，差异有统计学意义(t=16.235，P=0.006)。上述结果提示，Adv-SDF-1感染可上调dMSCs中SDF-1的表达水平，并可分泌到细胞外培养基中。

图1 Adv-SDF-1感染dMSCs前、后SDF-1表达变化(100×)

2.2 Adv-SDF-1感染的dMSCs移植后dMSCs存活情况

SCI后3 d，可见SCI处DAPI标记阳性dMSCs(图2A)，伤后7 d阳性细胞数量增多(图2B)，提示Adv-SDF-1感染的dMSCs移植后能够正常存活并增殖。

图2 Adv-SDF-1感染后dMSCs的存活情况(100×)

2.3 Adv-SDF-1感染后对Nestin阳性细胞的调动及修复作用

3组大鼠功能评估结果显示，移植细胞后7 d A组(6.70±0.52)分，高于B组(4.30±0.44)分及C组(4.10±0.48)分，差异有统计学意义(tA组VS B组=12.26，tA组VS C组=13.28，P<0.05)。

SCI后3 d，A组大鼠脊髓室管膜细胞Nestin阳性增加，SCI后7 d时其数量继续增加，中央导水管周围的脊髓组织内有Nestin阳性细胞，提示其可能是室管膜细胞迁移至损伤组织。而B、C组大鼠SCI后3、7 d在中央导水管及其周围的脊髓组织均未见到明显的Nestin阳性细胞(图3)。

图3 移植后损伤脊髓中Nestin免疫荧光染色(200×)

3 讨论

SCI指外界因素所致的脊髓受损，导致损伤区域的感觉、运动信号的传导改变，肌张力异常、出现病理反射，可表现为损伤节段以下肢体严重功能障碍，严重者可累及呼吸、泌尿等系统，甚至危及生命；SCI的治疗方法有手术治疗及非手术治疗，手术治疗主要在于手术解除压迫、内固定稳定脊柱；非手术治疗主要在于稳定脊柱、避免并发症及二次损伤，现有的治疗策略主要为减少SCI后的继发性损伤、应用刺激神经生长的因子和(或)阻断抑制轴突生长的物质促进轴突的再生、组织或细胞移植重建损伤脊髓的解剖连接、修复损伤的髓鞘和恢复损伤区神经纤维冲动传导以及促进中枢神经的可塑性变化[1-2]。现有的治疗措施对于急性及陈旧性SCI具有一定临床治疗效果，但目前对于SCI后如何促进神经功能恢复，促进神经再生修复尚无有效措施。

近年来, 随着干细胞技术的不断发展,应用干细胞治疗SCI的临床研究日益增多。一般认为，脊髓中的NSCs存在于软膜表面的放射状胶质细胞和位于中央管的室管膜细胞，且功能有可能不完全相同。目前，常用的内源性神经干细胞的标记有Nestin、Sox-2等，其中以Nestin最常用[7-9]，故在本研究中以Nestin 阳性的细胞来代表NSCs。SCI后脊髓白质中Nestin 阳性的细胞可能来源于放射状胶质细胞，而脊髓灰质中Nestin 阳性的细胞可能来源于中央管的室管膜细胞[7-9]。

SCI发生后，Nestin 阳性细胞可迁移到损伤局部参与损伤修复，但其数量相对有限，如何更多的得到NSCs及使其迁移至损伤部位是本研究的重点。为了提高内源性NSCs的修复效果，一些学者进行了有益的探索。Fan等[7]发现，在SCI局部注射粒细胞-巨噬细胞克隆刺激因子或移植树突状细胞可动员脊髓内源性NSCs参与损伤修复；Tashiro等[8]发现，SCI后功能锻炼可增加损伤脊髓中Nestin阳性细胞的数量，并同功能恢复呈正相关；而Bambakidis等[9]证实，SCI局部注射或静脉注射音猬因子后，可增加SCI局部内源性NSCs的数量。

研究[4,10-11]发现，SDF-1属于CXC 族趋化性细胞因子，在脊髓等多种损伤组织局部上调表达，可趋化表达其受体CXCR4的干细胞到损伤局部参与损伤修复。骨髓间充质干细胞、dMSCs和NSCs等多种干细胞均表达SDF-1的唯一受体CXCR4。因此，设想在SCI局部高表达SDF-1进而驱使脊髓本身NSCs向损伤局部迁移而达到脊髓修复的目的。由于具有取材方便、来源丰富、可进行自体移植等特点，皮肤来源的干细胞移植具有神经干细胞和胚胎干细胞等不具备的优势[12]。目前，已有多种类型的干细胞从皮肤中分离，如dMSCs、真皮纤维母细胞等[12]，dMSCs获得较为方便，因此本实验运用dMSCs来进行操作。

综上所述，本研究发现Adv-SDF-1感染dMSCs后SDF-1的表达明显上调，再将Adv-SDF-1感染的dMSCs移植到大鼠SCI局部， SCI局部高表达SDF-1。SDF-1修饰的dMSCs移植后在SCI局部有更多的NSCs，BBB评分也显示拥有更好的功能恢复。本研究仅就SDF-1对Nestin阳性细胞的吸引进行了初步观察，但很多问题仍需要进一步观察，如基因转染的安全性和致癌性问题等，将在以后的研究中对这些问题进行深入探讨。