高效液相色谱法测定丙戊酸钠中醋酸的含量

万阳浴,刘银坤,许小红△

1.四川科伦药业股份有限公司(成都 610071)；2.成都医学院 药学院(成都 610500)

丙戊酸钠是一种不含氮的广谱抗癫痫药，对多种原因引起的惊厥有不同程度的对抗作用，对各型癫痫如各型小发作、肌阵挛性癫痫、局限性发作、大发作和混合型癫痫均有效，临床上多与其他产品联合治疗癫痫类疾病[1]。口服吸收快而完全，主要分布在细胞外液，在血中大部分与血浆蛋白结合。根据厂家的合成工艺路线得知，该产品在合成工艺中所用的醋酸可能残留到产品中，而醋酸对人体皮肤、黏膜等具有一定的刺激性，现有的药典中未涉及到丙戊酸钠中残留醋酸含量测定；为保证丙戊酸钠原料药的质量，同时确保其注射液、片剂等制剂产品的用药安全，因此有必要对其残留含量进行研究，控制其残留量在中华人民共和国药典二部2015版[2]规定的0.5%限度范围内。

查阅相关研究[3]发现，醋酸的含量测定方法主要有酸碱滴定法、酶法、气相色谱法和液相色谱法。有实验[4-8]使用气相色谱法测定自制生长抑素中醋酸含量，利用气相色谱仪测定氢化可的松中残留的醋酸，发现气相色谱法的重现性较差，而酶法和酸碱滴定法的干扰较大，且一般用于常量分析。中华人民共和国药典二部2015版[2]所收载的醋酸测定方法和文献报道的方法多以液相色谱法为主，近年来有大量关于使用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定醋酸含量的研究[9-11]报道，结果均表明此方法良好。目前尚无关于丙戊酸钠中醋酸含量测定方法的文献报道，因此，本实验目的是建立使用HPLC测定丙戊酸钠中醋酸含量的方法，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

岛津LC-2030C Plus高效液相色谱仪，UV检测器(日本岛津公司)；CPA225D电子天平(德国赛多利斯公司)；pH计(德国赛多利斯公司)。丙戊酸钠(批号：1808P109、1909P105、1910P029，由台湾旭富制药有限公司提供)；醋酸对照品(批号：2017032001，纯度：以100.0%计算，由成都科隆化学品有限公司提供)；甲醇为色谱纯(成都科隆化学品有限公司)，磷酸为分析纯，水为超纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱为Nano ChromCore C8(4.6 mm×150 mm，5 μm)；以磷酸水溶液(磷酸调节pH值至2.3)为流动相A，以甲醇为流动相B，进行梯度洗脱，流速为0.5 mL/min，检测波长为210 nm，柱温40 ℃，进样体积10 μL(表1)。

表1 HPLC洗脱程序

1.3 溶液制备

1.3.1 空白溶液(稀释剂) 量取超纯水950 mL，用磷酸调pH至2.3，加入甲醇，混匀，即得。

1.3.2 对照品溶液 取醋酸对照品适量，精密称定，加稀释剂溶解并定量稀释制成每1 mL中约含10 μg的溶液，即得。

1.3.3 供试品溶液 取丙戊酸钠适量，精密称定，加稀释剂溶解并定量稀释剂制成每1 mL中约含丙戊酸钠2 mg的溶液，即得。

1.3.4 混合溶液 取丙戊酸钠适量，精密称定，加对照品溶液溶解并定量稀释剂制成每1 mL中分别约含丙戊酸钠2 mg、醋酸10 μg的溶液，即得。

2 结果

2.1 专属性

精密量取空白溶液、对照品溶液和供试品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，相关图谱如下(图1)。结果表明，空白及供试品均不干扰供试品溶液中醋酸测定，醋酸峰与相邻峰间分离良好。

图1 专属性色谱图

2.2 系统适用性

精密量取对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，连续进样6针。结果表明，醋酸峰的保留时间RSD为0.05%，峰面积RSD为0.5%，理论板数均>7 000，拖尾因子均<1.4，系统适用性良好。

2.3 灵敏度

取醋酸对照品溶液，用稀释剂逐级稀释，分别精密量取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按信噪比(S/N)约为10∶1为定量限，结果为5.4 ng，相当于供试品进样量的0.03%；按信噪比约为3∶1为检测限，结果为1.6 ng，相当于供试品进样量的0.01%，灵敏度能满足检测要求。

2.4 重复性

根据专属性实验结果得知，供试品中无醋酸检出，故取同一批供试品(批号：1808P109)平行配制6份混合溶液，按照“1.2”色谱条件测定，按外标法以峰面积计算混合溶液中加入醋酸的回收率，各回收率均在99.0%～101.0%，RSD为0.7%，重复性良好。

2.5 线性关系

精密量取100 mg/L的醋酸对照品溶液0.3、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，加稀释剂定容，摇匀，另取“2.3”项下定量限溶液。分别精密量取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以醋酸对照品溶液浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线和相关线性关系图，得到线性回归方程为Y =717.89X +26.96，相关系数r为1.000 0(图2)。结果表明，醋酸在进样浓度0.54～21.66 mg/L范围内线性关系良好。

图2 醋酸线性关系图

2.6 回收率

取丙戊酸钠约50 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，共9份，分成3组，备用。每组分别加入0.25 g/L的醋酸对照品溶液各0.5、1.0、1.5 mL，按照“1.2”色谱条件测定，按外标法以峰面积计算醋酸回收率，低、中、高3个浓度回收率(n=3)分别为100.4%、100.2%、100.9%，总回收率(n=9)为100.5%，RSD(n=9)为1.1，结果表明本研究方法准确度良好(表2)。

表2 加标回收率结果表

2.7 溶液稳定性

取同1份对照品溶液(同“1.3.2”项配制)和混合溶液(同“1.3.4”项配制)于冰箱中冷藏保存，分别于0、3、5 d取出，按“1.2”项色谱条件检测对照品溶液中醋酸含量和混合溶液中醋酸回收率，测得其RSD分别为2.3%和1.9%。结果表明，对照品溶液和混合溶液于冰箱中冷藏保存5 d内稳定性良好。

2.8 样品中醋酸含量测定

取3批丙戊酸钠原料药，同“1.3.2”和“1.3.3”项制备方法，分别制备对照品溶液和供试品溶液，参照“1.2”项色谱条件进样分析，结果显示各批次样品中均未检出醋酸残留。

3 讨论

3.1 pH确定

采用中华人民共和国药典二部2015版[2]中所收载的测定醋酸的方法，醋酸峰峰形较差，可能与丙戊酸钠的存在有关，调节pH至2.5以下可获得良好峰形，但同时考虑到色谱柱的pH承受范围，故选择了pH为2.3。

3.2 色谱柱确定

在方法开发阶段，选择用C18色谱柱也能获得峰形良好的醋酸峰，但丙戊酸钠在C18填料的色谱柱上保留过强，不出峰。为防止进样过多导致色谱柱堵塞，故更换C8填料的色谱柱，使供试品中主成分丙戊酸钠能正常洗脱。

综上所述，本实验建立了使用HPLC测定丙戊酸钠中醋酸含量的方法，方法学验证结果表明此方法良好，确认可行。