脑血通片质量标准研究

童志远，古　雪，颜晓燕，陈　燕，代　晶△

1.成都医学院第一附属医院 药剂科(成都　610513)；2.成都医学院 药学院(成都　610083)



脑血通片质量标准研究

童志远1，古雪2，颜晓燕2，陈燕2，代晶2△

1.成都医学院第一附属医院 药剂科(成都610513)；2.成都医学院 药学院(成都610083)

目的建立脑血通片的含量测定方法，完善其质量标准。方法采用紫外可见分光光度法建立脑血通片中总黄酮、总氨基酸含量测定方法。结果芦丁、谷氨酸分别在10.02～60.12 μg·mL-1(r=0.9 999)、 2.009～10.044 μg·mL-1(r=0.9 990)范围内线性关系良好，平均加样回收率分别为101.86%(RSD=2.20%)、101.32%(RSD=2.37%)，3批制剂中总黄酮、总氨基酸含量分别为66.73、29.44 mg·g-1。结论本研究建立的方法简单，结果准确，重现性好，可用于脑血通片的质量控制。

脑血通片；紫外可见分光光度法；总黄酮；总氨基酸

脑血通片是成都医学院第一附属医院的自制制剂，主要由丹参、当归、红花、川芎、蜈蚣等12味药材组成，具有活血化瘀，通络止痛功效，主要用于脑动脉硬化、脑血管痉挛所致头痛，其临床应用效果显著，无明显不良反应，患者反馈较好。但由于其成分复杂，所含药材较多，且同时含有植物药和动物药，目前尚未建立有效的质量控制标准。为有效控制脑血通片的质量，保证用药安全有效，实验组前期主要以药典为参考资料[1-2]，选取了需粉碎入药的白芷、丹参、蜈蚣、蝎子进行显微鉴别；采用TLC法对制剂中的丹参、川芎、当归进行了定性鉴别。同时，也尝试使用HPLC法建立脑血通片的含量测定方法，但在实验中发现由于本制剂成分复杂，杂质干扰较大，难以对单一成分进行分离，且含量较低难以定量。根据查阅的资料[1]显示，处方中丹参、当归、红花、蔓荆子等多味药材中含有大量的黄酮类成分，而处方中含有的多味动物药(如蜈蚣、全蝎等)及丹参、当归等也富含氨基酸。研究[3-14]报道，通过紫外可见分光光度法测定中药材或中成药中总黄酮、总氨基酸成分的方法已较为成熟。分光光度法测黄酮、氨基酸含量常用直接测定法和显色测定法。直接测定法[8]依据黄酮、氨基酸自身结构特点，不使用显色剂，直接在其特征吸收峰处对供试样进行测定。该方法对单一成分的样品测定简便、快速、准确；但对成分复杂的中药复方制剂而言，杂质的干扰大，误差较大。一般认为显色测定法明显优于直接法测定的结果，且多糖、皂苷对实验均无干扰。通过文献研究，在前期实验的基础上，本研究拟定以总黄酮和总氨基酸作为指标性成分，采用紫外可见分光光度法中的显色测定法作为含量测定方法，旨在为脑血通片质量标准的建立提供依据。

1　仪器与试药

1.1试药

脑血通片(批号：20150116,20130723,20110524，成都医学院第一附属医院药剂科)；芦丁对照品(批号：MUST-15091104，纯度98.00%，购自成都曼斯特生物科技有限公司)；谷氨酸对照品(批号：140690-200802，纯度100.00%，中国药品生物制品检定所)；亚硝酸钠(批号：20150611，天津博迪化工股份有限公司)；硝酸铝·9H2O(批号：2015012801，成都市科龙化工试剂厂)；氢氧化钠、茚三酮(批号：20151110，20150529，天津市瑞金特化学品有限公司)；无水醋酸钠、冰乙酸(批号：2015121044，2015102031，天津致远化学试剂有限公司)；试剂均为分析纯，水均为纯化水。

1.2仪器

紫外可见分光光度计(型号：BlueStar A，北京莱博泰科仪器股份有限公司)；Thermo微量台式离心机(型号：Heraeus Pico 17，美国赛默飞世尔科技公司)；调温电热套(型号：ZDHW，北京中兴伟业仪器有限公司)；电子分析天平(型号：BP211D，赛多利斯科学仪器有限公司)；电热恒温水浴锅(型号：HH-S4型，北京科伟永兴仪器有限公司)；pH计(型号：pHS-3C，成都世纪方舟科技有限公司)。

2　方法与结果

2.1总黄酮的含量测定方法建立[3-8]

2.1.1溶液配制1)芦丁对照品溶液的制备：精密称定芦丁对照品10.02 mg，置于10 mL容量瓶中，用适量80%的乙醇[3]溶解后，定容，摇匀，作为对照品储备液。精密吸取该对照品储备液5.0 mL于25 mL容量瓶中，用80%的乙醇定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.2 004 mg·mL-1的芦丁对照品溶液。2)总黄酮样品溶液的制备：取脑血通片20片，研磨成粉，精密称取片粉0.2 g，置于圆底烧瓶中，加入200倍量的60%乙醇，加热回流，沸腾后提取30 min， 冷却至室温，用60%的乙醇补足减失的重量，摇匀，离心(10 000 r，5 min)，滤过(0.45 μm)，取续滤液，即得。

2.1.2检测波长的选择精密吸取芦丁对照品溶液2.0 mL，置于10 mL容量瓶中，用80%乙醇补足3 mL后，加入5%亚硝酸钠0.3 mL，摇匀，放置6 min， 加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min， 再加入4%氢氧化钠溶液4 mL，摇匀，加80%乙醇至刻度，摇匀，放置15 min后，以相应试剂为空白，在400～600 nm的波长范围内进行扫描，结果显示芦丁在508 nm处有最大吸收，故选择检测波长为508 nm。

2.1.3总黄酮样品溶液的制备条件筛选1)提取溶剂考察：精密称定脑血通片粉0.5 g，共8份，分别置于圆底烧瓶中，各加200倍量的水、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇，加热回流，沸腾后提取30 min，冷却至室温，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，离心(10 000 r，5 min)，滤过(0.45 μm)，取续滤液，得各供试品溶液。分别精密吸取1.0 mL于10 mL容量瓶中，按2.1.2项下方法显色后，以样品本底为空白，在508 nm处测定吸光度。计算得总黄酮相对百分含量分别为91.14%、93.01%、95.67%、100.49%、100.00%、99.58%、95.79%、81.89%，结果表明，乙醇浓度为50%～70%时，提取量最大，故选择60%乙醇为提取溶剂。2)料液比考察：精密称定脑血通片粉0.5 g，共5份，分别置于圆底烧瓶中，以60%乙醇为溶剂，料液比分别为1∶100、 1∶150、1∶200、1∶250、1∶300，其余操作同2.1.3 1)项下方法。计算得总黄酮含量分别为59.03、60.43、60.44、60.46、61.49 mg·g-1，结果表明，料液比对提取量影响较小，故为方便后续实验，选择料液比为1∶200。3)提取时间考察：精密称定脑血通片粉0.5 g，共6份，分别置于圆底烧瓶中，以60%乙醇为溶剂，料液比为1∶200，提取时间分别为10、20、30、40、50、60 min(沸腾时开始计时)，其余操作同2.1.3 1)项下方法。计算得总黄酮相对百分含量分别为96.06%、98.48%、100.00%、100.16%、100.16%、100.47%，结果表明,30 min后提取量趋于稳定，故选择提取时间为30 min。4)提取温度考察：精密称定脑血通片粉0.5 g，共6份，分别置于圆底烧瓶中，以60%乙醇为溶剂，料液比为1∶200，提取时间为30 min(沸腾时开始计时)，提取温度分别为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃，80 ℃、沸腾温度，其余操作同2.1.3 1)项下方法。计算得总黄酮含量分别为59.30、59.68、60.65、61.36、62.63、63.88 mg·g-1，结果表明,随着提取温度的升高，提取量逐渐增加，故选择沸腾温度为提取温度。

2.1.4标准曲线的制备精密吸取芦丁对照品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL分别置于10 mL容量瓶中，按2.1.2项下方法显色后，得对照品系列标准溶液，以第一份为空白，在508 nm处测定吸光度。以对照品浓度为横坐标(X)，吸光度A为纵坐标(Y)进行线性回归，得回归方程：Y=12.769X-0.0 044(r=0.9 999)， 表明芦丁在10.02～60.12 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.1.5加样回收试验精密称定已知含量(65.84 mg·g-1)的片粉0.05 g 6份，分别加入3.2 960 mg芦丁对照品，按2.1.1 2)项下方法制备各供试品溶液。分别取1.0 mL按2.1.2项下方法操作显色后，在508 nm处测定吸光度并计算回收率。平均回收率为101.86%，RSD为2.20%，表明该含量测定方法加样回收率良好。

2.2总氨基酸含量测定方法的建立[9-14]

2.2.1溶液配制提取1)2%茚三酮溶液的配制：精密称取茚三酮2 g，置于100 mL棕色量瓶中，加乙醇适量溶解后，定容至刻度，摇匀，避光保存。2)谷氨酸对照品溶液的制备：精密称定谷氨酸对照品25.11 mg，置于25 mL容量瓶中，用适量水溶解后，定容，摇匀，作为对照品储备液。精密吸取该对照品储备液2.5 mL于25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.1 004 mg·mL-1的谷氨酸对照品溶液。3)总氨基酸样品溶液的制备：取脑血通片20片，研磨成粉，精密称取片粉0.2 g，置于圆底烧瓶中，加入200倍量的水，60 ℃水浴加热回流提取30 min，冷却至室温，并用水补足减失的重量，摇匀，离心(12 000 r， 5 min)，滤过(0.45 μm)，取续滤液，即得。

2.2.2检测波长的选择精密吸取谷氨酸对照品溶液1.5 mL，置于25 mL容量瓶中，用水补足5 mL后，加入醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 6.0)1.0 mL，摇匀，加入2%茚三酮溶液1.0 mL，摇匀，沸水浴15 min， 待冷却至室温，用水定容至刻度，摇匀。以相应试剂为空白，在500～700 nm的波长范围内进行扫描，结果显示谷氨酸在570 nm处有最大吸收，故选择检测波长为570 nm。

2.2.3总氨基酸样品溶液制备条件筛选1)提取溶剂考察：精密称定脑血通片粉0.2 g，共6份，分别置于圆底烧瓶中，分别加200倍量的水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、无水乙醇，加热回流，沸腾后提取30 min，冷却至室温，并用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，离心(12 000 r，5 min)，滤过(0.45 μm)，取续滤液，得各供试品溶液。分别精密吸取1.0 mL于25 mL容量瓶中，按2.4.2项下方法显色后，以沸水浴前溶液为空白，在570 nm处测定吸光度。计算得总氨基酸含量分别为30.15、30.07、27.83、25.45、18.78、7.75 mg·g-1，结果表明，乙醇浓度越大，提取量越小，水为提取溶剂时，提取量最大，故选择水为提取溶剂。 2)料液比考察：精密称定脑血通片粉0.2 g，共5份，分别置于圆底烧瓶中，以水为溶剂，料液比分别为1∶100、1∶150、1∶200、 1∶250、1∶300，其余操作同2.2.3 1)项下方法。计算得总氨基酸含量分别为25.00、26.93、29.69、29.87、29.51 mg·g-1，结果表明，当料液比增至1∶200后，提取量逐渐趋于稳定，故为方便后续实验，选择料液比为1∶200。3)提取时间考察：精密称定脑血通片粉0.2 g，共6份，分别置于圆底烧瓶中，以水为溶剂，料液比为1∶200，提取时间分别为10、20、30、40、50、60 min(沸腾时开始计时)，其余操作同2.2.3 1)项下方法。计算得总氨基酸含量分别为23.00、27.76、30.42、30.08、29.16、27.66 mg·g-1，结果表明, 30 min后提取量开始下降，故选择提取时间为30 min。4)提取温度考察：精密称定脑血通片粉0.2 g，共7份，分别置于圆底烧瓶中，以水为溶剂，料液比为1∶200，提取时间为30 min，提取温度分别为40、50、60、70、80、90、100 ℃，其余操作同2.2.3 1)项下方法。计算得总氨基酸含量分别为28.85、30.73、32.58、32.43、31.83、30.06、29.51 mg·g-1， 结果表明,60～80 ℃提取量较高，故选择60 ℃为提取温度。

2.2.4标准曲线的制备精密吸取谷氨酸对照品溶液0.5、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5 mL分别置于25 mL容量瓶中，按2.2.2项下方法显色后，得对照品系列标准溶液，以相应试剂为空白，在570 nm处测定吸光度。以对照品浓度为横坐标(X)，吸光度A为纵坐标(Y)进行线性回归，得回归方程：Y=0.08 871X-0.08 557(r=0.9 990)。表明谷氨酸在2.009～10.044 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.2.5加样回收试验精密称定已知含量32.35 mg·g-1的片粉0.1 g 6份，分别加入3.2 141 mg谷氨酸对照品，按2.2.1 3)项下方法制备各供试品溶液。分别取1.0 mL按2.2.2项下方法操作显色后，在570 nm处测定吸光度，计算回收率。平均回收率为101.32%，RSD为2.37%，表明该含量测定方法加样回收率良好。

2.3样品测定

取3批样品，分别按上述方法测定总黄酮和总氨基酸含量，每批平行测定3次，3批制剂总黄酮、总氨基酸平均含量分别为66.73、29.44 mg·g-1(表1)。

表1　样品测定结果

3　讨论

中成药质量标准研究的含量测定方法[15-16]包括：分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法等。目前最常用的是高效液相色谱法，前期实验发现，本制剂成分复杂，难以对单一成分进行分离，且含量较低难以定量。根据资料[1]显示，处方中丹参、当归、红花、蔓荆子等多味药材中含有大量的黄酮类成分，多味动物药(如蜈蚣、全蝎等)及丹参、当归等富含氨基酸，同时据文献报道，通过UV-VIS法测定中药材或中成药中总黄酮、总氨基酸的方法已较为成熟。分光光度法测黄酮、氨基酸常用的有直接测定法和显色测定法，直接测定法不使用显色剂,依据黄酮、氨基酸自身结构的特点,直接在其特征吸收峰处对供试样进行测定[8]。该方法对单一成分的样品测定简便、快速、准确；但对成分复杂的中药复方制剂来说，杂质的干扰大，易出现误差。一般认为显色法优于直接法测定的结果，且多糖、皂苷对实验均无干扰[8]。因此在前期实验的基础上，本试验拟定以总黄酮和总氨基酸作为指标性成分，采用UV法中的显色测定法作为含量测定的研究方法。经方法学考察证明，该方法可用于脑血通片的日常检验和质量控制。

综上所述，总黄酮和总氨基酸的含量测定结果表明，不同批次的脑血通片中总黄酮和总氨基酸的含量有所差异，这是由于脑血通片为中药制剂，其质量受中药材产地、采集季节[7-9]等多种复杂因素的影响，药材质量参差不齐，导致了样品间的质量差异。因此未来的研究还需对更大批量的制剂进行含量测定，确定其总黄酮、总氨基酸含量的限度。

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Study on the Quality Standard of Naoxuetong Tablets

TongZhiyuan1,GuXue2,YanXiaoyan2,ChenYan2,DaiJin2△.

1.TheFirstAffiliatedHospital,ChengduMedicalCollege,Chengdu610513,China; 2.SchoolofPharmacy,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China

ObjectiveTo establish a method for the content determination of Naoxuetong Tablets and improve its quality standard. MethodsUV-Visible spectrophotometry was adopted to establish the method to assay the content of total flavonoids and total amino acid in Naoxuetong Tablets. ResultsThe contents of rutin and glutamic acid showed a good linear relationship in the range of 10.02μg·mL-1～60.12μg·mL-1(r=0.9 999) and 2.009μg·mL-1～10.044μg·mL-1(r=0.9 990) respectively, and the average recoveries were 101.86% (RSD=2.20%) and 101.32% (RSD=2.37%) respectively. The average contents of total flavonoids and total amino acid of three batches of Naoxuetong Tablets were 66.73 mg·g-1and 29.44 mg·g-1respectively. ConclusionThe established method is simple, accurate and reproducible, so it can be adopted to control the quality of Naoxuetong Tablets.

Naoxuetong Tablets; UV-visible spectrophotometry; Total flavonoids; Total amino acid

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.04.019

R283.6

A

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.r.20160728.1740.012.html