小剂量叶酸预防妊娠期高血压有效剂量的实验研究*

曾子倩，欧 愚，冷言冰，朱彦锋，余小平，薛清萍，李亚超，韩 彬

成都医学院 公共卫生系(成都 610500)

小剂量叶酸预防妊娠期高血压有效剂量的实验研究*

曾子倩，欧 愚，冷言冰，朱彦锋，余小平，薛清萍，李亚超，韩 彬△

成都医学院 公共卫生系(成都 610500)

目的 探讨不同剂量叶酸对高同型半胱氨酸妊娠期SD大鼠血清叶酸及血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平的影响作用，找出预防妊娠期高血压的最佳有效剂量。 方法 将40只12周龄雌性SD大鼠按照叶酸干预剂量分为4组：低、中、高3个剂量叶酸组[0.8 mg/(kg·d)，n=10]，中剂量叶酸组[1.6 mg/(kg·d)，n=10]、高剂量叶酸组[2.0 mg/(kg·d)，n=10]和对照组(灭菌水500 μL，n=10)。干预7 d后，将雌鼠和同品类雄鼠合笼，第2～3 天进行阴道栓检测，将受孕大鼠纳入研究，采用1%蛋氨酸饮食建立高同型半胱氨酸模型，干预前后分别抽取血液样本，测定各组血清叶酸及血浆Hcy水平。 结果 32只雌鼠受孕并纳入干预研究，4组SD大鼠体质量在干预前后比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；中剂量叶酸组、高剂量叶酸组与对照组比较，叶酸水平升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，高剂量叶酸组SD大鼠Hcy水平降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。 结论 不同剂量叶酸干预效果存在差异，在安全剂量下，高剂量组叶酸能够提高妊娠期SD大鼠的叶酸水平和降低Hcy水平，从而达到预防妊娠期高血压的目的。

叶酸；妊娠期高血压；实验研究

妊娠期高血压疾病是产科常见的一类综合征。世界卫生组织公布的数据中曾提到，2015年全世界约有30万妇女死于妊娠相关疾病，约有260万例死产婴儿[1]。而妊娠期高血压既是导致死产的前5位原因之一，也是我国孕产妇死亡的前3位原因之一，发生率达9.4%，较国际报道的平均发病率6.4%～7.0%更高[2]。同型半胱氨酸(Hcy)是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的重要中间产物，当Hcy高于15.0 mol/L称为高同型半胱氨酸血症(Hhcy)。研究发现，妊娠期高血压的发生与Hhcy密切相关，而叶酸在降低血清Hcy水平中所起到的作用也日益被研究者认可。然而，长期服用不恰当剂量叶酸(≥1 mg/d)同样存在安全隐患，如过量叶酸容易掩盖B-12缺乏，从而导致贫血或老年认知障碍等疾病[3-4]。我国对孕期妇女的叶酸增补建议为孕前3个月和孕早期每天服用0.4 mg叶酸[5]，但这一剂量和时长在我国针对妊娠期高血压的研究中未见明显效果(RR=1.08)[6]。基于叶酸对高血压预防作用的文献回顾[7-8]，不同剂量、不同增补时长的叶酸对Hcy的作用效果存在差异。本研究采用动物实验对叶酸降低妊娠期Hcy水平的有效剂量进行了研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

1.1.1 动物选择及样本量 选择12周±4 d周龄SD雌大鼠，体质量250～270 g(成都达硕动物科技有限公司提供)。共设置3个剂量组和1个对照组，按最低剂量组与对照组比较能够出现统计学差异来计算每组样本量，参照人卫版《动物实验方法学》样本量计算公式，设定α=0.05，β=0.2计算每组样本量为5只，考虑到雌鼠的受孕概率及实验可能造成的动物死亡，故共选取大鼠40只，每组10只，以保证实验中样本量充足。

1.1.2 动物饲养及分组 动物于室温(24±2)℃，湿度(60±10)%，明暗循环12 h条件下饲养，饮水摄食自由。采用实验流行病学中随机、对照、双盲设计，按照随机数字表法，将40只大鼠随机分成4组，每组10只大鼠。在本研究中，按照孕期妇女平均体质量50 kg的增补剂量0.4、0.8、1.0 mg/d分为3个剂量组，参照剂量换算方法[9]，估计雌性大鼠体质量为250～300 g, 大鼠的喂养剂量分别为：0.8 mg/(kg·d)(低剂量叶酸组), 1.6 mg/(kg·d),(中剂量叶酸组) 2.0 mg/(kg·d)(高剂量叶酸组)。对照组灌胃灭菌水500 μL/d。

1.2 实验叶酸干预

对照组大鼠每天灌胃灭菌水，低、中、高3个剂量叶酸组每只大鼠分别按0.8、1.6、2.0 mg/(kg·d)剂量灌胃叶酸，干预7 d后，将雌鼠和同品类雄鼠合笼，第2、3 天连续进行阴道栓检测，将受孕大鼠纳入研究，采用1%蛋氨酸饮食建立Hhcy模型，孕期前7 d和孕期结束后大鼠眼眶静脉取血，在含有EDTA的抗凝管中，以3 000 r/min离心10 min，取上层血清及血浆，-20 ℃冰箱保存。

1.3 大鼠Hhcy建模

4组大鼠均于孕8 d开始，予以1%蛋氨酸饲料喂养，构建妊娠期Hhcy模型。同时，每天给予3个干预组大鼠叶酸制剂干预，灌胃给药；每天给予对照组大鼠灭菌水灌胃。

1.4 指标测定及方法

1.4.1 基本情况观察 实验期间每天观察SD大鼠毛发、粪便及活动情况，并记录摄食和饮水情况；每周对SD大鼠进行称重。

1.4.2 大鼠血清叶酸浓度测定 血清叶酸测定用ELISA法，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4.3 大鼠血浆Hcy浓度测定 大鼠眼眶静脉取血，采用高效液相色谱法测量进行Hcy测定。

1.5 检测试剂

叶酸购自美国Sigma公司，蛋氨酸购自北京索莱宝科技有限公司，血清ELISA检测试剂盒购自美国Sigma试剂公司。酶标仪购自美国Thermo 公司。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 基本情况

根据受孕情况，每组最终纳入8只受孕大鼠进行干预。实验期间，大鼠毛发、粪便、活动等正常，对照组和低、中、高剂量叶酸组大鼠体质量缓慢增长(表1)，饮水及摄食量比较，差异均无统计学意义(表2)，实验过程中大鼠无死亡。实验数据进行重复测量方差分析，每周进行大鼠体质量监测，不同周数的体质量比较，差异有统计学意义(F=166.88，P<0.001)；不同组别间大鼠的体质量比较，差异无统计学意义(F=0.14，P=0.935)；时间与区组间未存在交互效应(F=0.24，P=0.996)。结果提示，本实验的叶酸剂量对大鼠无明显毒副作用。

表1 实验期间4组SD大鼠体质量变化情况

表2 SD大鼠进食情况比较

2.2 大鼠血清叶酸水平变化情况

干预前，单因素方差分析结果显示，4组大鼠血清叶酸水平均存在统计学差异(F=8.63，P<0.003)；经不同剂量叶酸干预后，协方差分析结果显示，不同剂量组之间血清叶酸水平比较，差异有统计学意义(F=41.39，P<0.001)；两两比较结果显示，中剂量(1.60 mg/kg)、高剂量叶酸组(2.0 mg/kg)大鼠血清叶酸与对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.001)，且高剂量叶酸组大鼠血清叶酸含量最高(表3)。

表3 SD大鼠干预前后血清叶酸水平比较

注：与对照组相比：*P<0.05

2.3 大鼠血浆Hcy水平变化

干预前，4组大鼠血浆Hcy水平比较，差异均无统计学意义(表4)，经不同剂量叶酸干预以及1%蛋氨酸饲料喂养后，统计分析结果显示，各组大鼠血浆Hcy水平不同(F=127.529，P<0.01)，两两比较结果显示，中、高剂量组血浆Hcy水平与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，且中、高剂量组血浆Hcy水平降低，提示中、高剂量叶酸能够降低1%蛋氨酸诱导的大鼠血浆Hcy水平。

表4 SD大鼠干预前后血浆Hcy水平比较

注：与对照组相比：*P<0.05

3 讨论

妊娠期高血压的发病机制十分复杂，国内外研究者对此提出了多种学说，其中，研究发现，Hcy水平是妊娠高血压的一个独立危险因素，容易引起不良的妊娠结局如妊娠高血压或先兆子痫[10]。Hcy是一种含硫基的非必需氨基酸，为蛋氨酸代谢的一个重要代谢产物，其代谢异常可导致Hhcy，Hhcy会损伤血管内皮细胞，引起血液流变学、凝血系统、纤溶系统和微循环的紊乱，从而参与妊娠高血压的发生、发展过程。叶酸是一种B族维生素，研究表明，增补叶酸可以增加血管内皮细胞合成一氧化氮，同时，叶酸作为Hcy代谢过程中重要的辅助因子，其水平的增高可促进Hcy的再甲基化进行，从而降低血清Hcy的浓度，达到降低Hhcy血压的目的[11]。

大量研究显示，叶酸对妊娠期高血压的预防作用尚未达成共识，而增补剂量很可能是影响因素之一。最新研究[12]发现，服用叶酸可以降低罹患妊娠期高血压的风险(RR=0.62)，其他类似研究[13]结论同样支持这一结果。然而，叶酸对妊娠期高血压疾病的预防作用在该领域研究中仍缺乏共识，Shim 等[14]研究显示，单独叶酸或者复合维生素的增补并未有效减少妊娠期高血压或者先兆子痫的发病风险；2013年，我国一项大样本队列研究发现，育龄妇女在孕早期3个月每天增补0.4 mg叶酸对预防妊娠期高血压并无显著预防效果[6]。

本实验采用低剂量蛋氨酸饲养来构建SD大鼠的高Hcy水平模型，孕前及孕期服用叶酸来控制Hcy水平的升高。结果发现，采用1%的蛋氨酸进行Hhcy血症的建模成功，这与之前孟斌等[15]研究结果一致。分别经灭菌水和叶酸干预后，4组大鼠的Hcy水平均有所提高，而叶酸干预组Hcy水平提高较慢，且叶酸干预末期与对照组比较，Hcy水平差异有统计学意义。

对于叶酸的增补剂量，目前大多数研究推荐孕妇的增补剂量为0.4 mg/d，用于预防神经管缺陷、先天性心脏病等出生缺陷。但临床数据发现，孕前与孕早期0.4 mg/d的增补对妊娠期高血压的预防作用并不显著。本实验发现，在SD大鼠中，叶酸增补剂量的增加会使血清叶酸水平提高，从而降低血浆Hcy水平。但在3个剂量中，1.6 mg和2.0 mg剂量较0.8 mg剂量在血清叶酸增长中效果更为显著，但在降低Hcy水平中，二者干预后的Hcy水平比较，差异并无统计学意义，因此，在剂量的选择上，1.6 mg是取得控制妊娠期大鼠Hcy水平的最小剂量。

综上所述，本研究通过动物实验进行了叶酸预防妊娠期高血压最佳有效剂量的探索，但叶酸增补的时长也是影响预防效果的因素之一，因此需要进一步开展实验进行研究。

[1]WHO. Pregnant women must be able to access the right care at the right time, says WHO[R/OL]．2016．http://www.who.int/mediacentre/news/releases/2016/antenatal-care-guidelines/en/.

[2]曹泽毅. 中华妇产科学[M].北京:人民卫生出版社,2008:398.

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An Experimental Study on the Optimal Dose of Folic Acid Intake to Prevent the Gestational Hypertension

ZengZiqian,OuYu,LengYanbing,ZhuYanfeng,YuXiaoping,XueQingping,LiYachao,HanBin△.

DepartmentofPublicHealth,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

Objective To explore the effects of different doses of folic acid intake among pregnant SD mice with hyper-homocysteine and investigate the optimal dose for gestational hypertension. Methods 40 female SD mice with the age of 12 weeks were selected in the study and divided into four groups including high dose group (2.0 mg/kg·d), medium dose group (1.6 mg/kg·d), low dose group (0.8 mg/kg·d) and the control group, and each group consisted of 10 mice. The cohabitation of those female mice and the other male mice of same category was made after 7-day intervention. Then the vaginal suppository test was adopted after 2 to 3 days, and the pregnant mice were selected to create the hyper-homocysteine model with 1% methionine. The blood samples were collected before and after intervention respectively and assayed to determine the levels of serum folate and homocysteine. Results 32 pregnant mice were included in the intervention study. The weights of the SD mice in the three groups of low, medium and high doses were not significantly different from those in the control group before intervention. After the intervention, the levels of serum folate in the groups of medium and high doses were significantly higher than those in the control group (P<0.05); the level of homocysteine in the high dose group was significantly lower than that in the control group (P<0.05). Conclusion The intervention effects are different among the different doses of folic acid intake, and the high-dose intake of folic acid could increase the level of serum folate in pregnant SD mice and decrease the level of serum homocysteine for the purpose of preventing gestational hypertension with safe dose.

Folic acid; Gestational hypertension; Experimental study

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170116.1700.004.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.01.008

成都医学院自然科学基金资助项目(No: CYZ14-018)

R181.2+4

A

△通信作者：韩彬，E-mail:hanbin19871102@126.com