HPLC-DAD法评价青钱茶对α-葡萄糖苷酶的抑制活性*

张 勇 高桂花

(济宁医学院药学院，日照 276826)

α-葡萄糖苷酶能催化α-1,4-糖苷键水解，使小肠内麦芽糖、蔗糖等寡糖水解。通过抑制该酶的活性，可减缓葡萄糖的生成及吸收，调整血糖水平。青钱茶是青钱柳叶、黄芪、山药及绿茶制成的泡茶饮，具有降糖作用。其降糖机制可能为竞争性抑制α-葡萄糖苷酶，故评价其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性具有十分重要的意义。

目前关于α-葡萄糖苷酶抑制剂体外评价方法主要采用紫外分光光度法[1-2]。但当抑制剂本身在测定波长下具有紫外吸收时，会对测定产生干扰，影响结果的准确度。本实验采用高效液相色谱法-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)法，将干扰物质与产物分离后[3-4]，对产物进行准确测定，从而达到精准评价α-葡萄糖苷酶抑制剂活性的目的。现报道如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Shimadzu LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津)；BP211D电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ-500DB型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；酸度计(上海精密科学仪器有限公司)；台式高速离心机(湘仪仪器厂)。

1.2 试药

α-葡萄糖苷酶(北京百灵威科技有限公司)；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)(北京百灵威科技有限公司，纯度98%)；对硝基酚(PNP)(北京百灵威科技有限公司，纯度99%)；米格列醇(山东西亚化学工业有限公司，纯度≥98%)；乙腈(色谱纯，Burdick & Jackson)；青钱茶(江西省修水神茶实业有限公司)；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 试液的制备

1)0.1mol·L-1磷酸盐缓冲液(PBS)。精密称取0.68g磷酸二氢钾和0.705g磷酸氢二钠置100ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。

2)2.5mmol·L-1PNPG溶液。精密称取PNPG 18.81mg，置25ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。现用现配。

3)1U·ml-1α-葡萄糖苷酶溶液。精密称取α-葡萄糖苷酶100U，置100ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。于冰箱中冷藏保存。

4)0.2mol·L-1反应终止液。精密称取无水碳酸钠0.216g，置100ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。

5)5mmol·L-1PNP对照品溶液。精密称取PNP 17.42mg，置25ml容量瓶中，加磷酸盐缓冲液溶解至刻度，摇匀。

2.2 供试品溶液的制备

1)青钱茶提取物。取青钱茶3.0g，加沸水250ml，室温浸泡15min，滤过，再同法浸泡两次，滤液浓缩，蒸干，即得。

2)青钱茶供试品溶液。取青钱茶水提取物适量，溶于磷酸盐缓冲液中，得青钱茶供试品溶液。

3)米格列醇供试品溶液。取米格列醇适量，溶于磷酸盐缓冲液中，得米格列醇供试品溶液。

2.3 α-葡萄糖苷酶活性抑制试验

α-葡萄糖苷酶抑制剂体外活性筛选是以PNPG作为底物，PNPG在α-葡萄糖苷酶的作用下可分解产生PNP，以PNP作为检测物评价α-葡萄糖苷酶抑制剂的活性[5-8]，按照表1取PBS、α-糖苷酶试液，米格列醇供试品溶液及青钱茶供试品溶液，混匀，37℃孵育10min。再分别加入PNPG溶液，混匀，37℃反应90min后，加反应终止液混匀，终止反应，制得空白对照溶液、阳性对照溶液及样品溶液。采用高效液相色谱法测定生成的PNP，按下式计算抑制率。

表1 反应液体积/μl

2.4 色谱条件

色谱柱为Diamonsil C18(2)柱(200×4.6mm，5.0μm)；流动相：0.3%乙酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱程序为0～25min，10%～90% B；25～27min，90%～10% B；27～35min，10% B；流速1ml·min-1；柱温35℃；检测波长为315nm；进样量10μl。

2.5 含量测定方法学验证

2.5.1专属性试验 取样品溶液、阳性对照溶液及空白对照溶液各10μl，按“2.4”项下色谱条件进样分析。结果显示，空白对照、PNPG及杂质均不干扰PNP的测定。色谱图见图1。

注：Ⅰ-样品溶液；Ⅱ-阳性对照溶液；Ⅲ-空白对照溶液

2.5.2线性关系考察 取PNP溶液，逐级稀释制成17.42、34.84、69.68、139.36、348.4μg·ml-1的溶液。经0.45μm滤膜过滤后，进样10μl。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，计算回归方程。结果PNP在17.42～348.4μg·ml-1范围内线性良好，回归方程为Y=5299920X+593618(r=0.9997)。

2.5.3精密度试验 取PNP标准溶液，按“2.4”项下色谱条件，连续进样6次，记录峰面积，结果，PNP峰面积RSD为0.52%，表明仪器精密度良好。

2.5.4稳定性试验 取同一份青钱茶样品溶液，按“2.4”项下色谱条件，分别在0、2、4、6、8、10h进样，记录峰面积，结果PNP峰面积RSD为0.6%，表明对照品溶液在10h内稳定性良好。

2.5.5检测限和定量限 取PNP对照品溶液，逐级稀释，制备对照品溶液进样10μl，以S/N=3∶1时PNP的质量为检测限，S/N=10∶1时PNP的质量为定量限。结果PNP的检测限为0.1ng，定量限为0.2ng。

2.5.6加样回收率及重复性试验 取青钱茶提取物50.12mg，置10ml容量瓶中，加磷酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度，得5.012mg·ml-1的青钱茶提取物溶液。分别取青钱茶提取物溶液25、25、25μl，PNP溶液11、14、17μl，PBS溶液14、11、8μl混匀作为供试品溶液，按照“2.3”方法制备抑制样品溶液，每个水平平行3份。按“2.4”项下色谱条件，测定PNP浓度，计算回收率，结果见表2，平均回收率为98.8%，RSD为1.5%。

取上述青钱茶提取物溶液25μl、PBS溶液25μl混合作为重复性供试品溶液，平行6份，按“2.3”项下方法制备抑制样品溶液，按“2.4”项下色谱条件，测定PNP浓度，计算抑制率。青钱茶提取物的抑制率重复性试验的RSD为1.9%，表明方法重复性良好。

表2 回收率试验结果(n=9)

2.6 样品测定

精密称取米格列醇及青钱茶提取物，按“2.3”项下方法制备抑制样品溶液，按“2.4”项下色谱条件进样测定，结果表明青钱茶提取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用，且具有浓度依赖性。见表3。

表3 样品测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

本实验采用液相色谱法测定PNP的优势在于经色谱柱分离后，中药提取物中组分不再干扰PNP的测定。鉴于青钱茶提取物中成分较多，采用梯度洗脱方式，以确保PNP测定不受干扰。分别考察了甲醇与乙腈作为有机相时的分离情况，在保留时间相近的情况下，使用乙腈时分离效果更好。添加乙酸能够改善峰形，减小拖尾。

3.2 酶促反应时间的优化

按照2.3确定的条件，以青钱茶提取物为抑制剂，分别在30、50、70、90、110、130min加入反应终止液终止反应，测定产物PNP的变化。结果在90min时PNP的产量已经足够，适宜高效液相色谱仪测定，确定反应时间为90min。

3.3 青钱茶α糖苷酶抑制活性

米格列醇是一种高效的α-葡萄糖苷酶抑制剂，对各种α-葡萄糖苷酶均有较强的抑制作用，尤其是对蔗糖酶和葡萄糖淀粉酶有更强的抑制作用。青钱柳叶其主要功能性成分为黄酮、多糖及三萜等类物质[9-12]，由青钱茶α-糖苷酶抑制活性实验结果可知，青钱茶提取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用具有浓度依赖性，等量10mg·ml-1的青钱茶提取物与2.5mg·ml-1的米格列醇的体外抑制作用相当，其IC50为1.7mg·ml-1。

综上所述，本文采用HPLC法成功将干扰物质与PNP分离，并准确测定PNP的含量，所建立的方法定量准确，操作简便，能够用于精准评价青钱茶对α-糖苷酶的抑制活性。同时，实验结果表明，青钱茶具有显著的抑制α-糖苷酶活性的能力，其抑制作用具有浓度依赖性，这为青钱茶进一步开发和利用提供了一定的依据。