D21S11和Penta D分型异常在21三体综合征鉴定中的应用*

庞潜潜 李长征 王业全 刘 奇 侯秀迪 崔 文Δ

(1济宁医学院司法鉴定中心，2济宁医学院法医学与医学检验学院，济宁 272067)

短串联重复序列(short tandem repeats,STR)是一类在人类基因组中分布非常广泛的DNA长度多态性遗传标记，一般是2～6个碱基串联重复排列形成。因为STR的核心序列的重复次数的不同，使得STR具有极高的多态性。STR基因座等位基因命名来源就是其核心序列的重复次数，遵循孟德尔遗传规律，在亲权鉴定和个体识别中应用非常广泛，目前常用于分型的STR基因座多为4核苷酸重复的STR位点，个别位点是5核苷酸重复。在实践中,联合使用多个STR可以产生数亿的基因型组合，而每一种组合在群体中出现的频率都非常低，可以在很高的概率水平上认定嫌疑人。因此，STR基因座的PCR分型目前是国内外法医学亲缘鉴定和个体识别最主要的技术。欧盟法医DNA 分型标准化委员会认为，虽然近些年新的技术与新的遗传标记在不断地涌现,但在今后相当长时期内，STR 将仍然是法医学应用最主要的遗传标记[1]。

唐氏综合征(Down syndrome,DS)即21三体综合征，又称为先天愚型，是最常见的染色体数量异常疾病之一，表现为严重智力低下及发育异常，新生儿发病率约1/600～1/800[2]，患儿在出生时即表现出特殊面容。唐氏综合征主要是卵子减数分裂时 21 号染色体不分离，形成异常卵子导致胚胎发育障碍引起的[3]。目前正常孕检项目已包括唐氏筛查项目，并且唐筛高危人群可以选择羊水穿刺或者无创DNA技术进一步确认胎儿染色体数目是否正常。D21S11和Penta D是位于21号常染色体上的两个距离较近的STR基因座，相距大约25Mb，D21S11是一个四核苷酸重复的STR位点，Penta D是一个五核苷酸重复的STR位点，在法医学21三体综合征鉴定中具有重要应用价值[4-6]。

1 材料和方法

1.1 样本来源

受检样本来自济宁医学院司法鉴定中心法医物证实验室受理的亲权鉴定案件。样品采集时间为2018年4月10日，样品为血样，FTA卡采集，室温存放。具体案情为：被检母亲妊娠期唐氏筛查检测结果显示低风险，但是考虑到被检母亲为高龄产妇(38岁)，增加了无创DNA检测项目进行确定。无创DNA检测结果未显示有21三体综合征等遗传疾病的风险，被检母亲生产后发现新生儿出现21三体综合征患儿的特殊面容，因此需进行DNA检测以确定新生儿是否为21三体综合征患儿。被检母亲现场抽血(以下称为被检母亲)并提供了自称为新生儿的血样检材(以下称为血样检材)。

1.2 仪器与试剂

PCR扩增仪(AB公司，美国)；ABI-3500遗传分析仪(AB公司，美国)；GeneMapper ID-X 1.4软件(AB公司，美国)；Goldeneye 20A PCR扩增试剂盒(基点认知公司，中国)；华夏TM白金PCR扩增试剂盒(AB公司，美国)。

1.3 方法

1.3.1Goldeneye 20A PCR扩增试剂盒检测 用Goldeneye 20A PCR扩增试剂盒复合扩增Amelogenin基因座和19个STR基因座(D19S433，D5S818，D21S11，D18S51，D6S1043，D3S1358，D13S317，D7S820，D16S539，CSF1P0，Penta D，vWA，D8S1179，TPOX，Penta E，TH01，D12S391，D2S1338，FGA)。使用ABI 9700(金座)热循环仪，反应体系为10μl，含 H2O 3.84μl、PCR Reaction Mix 4.0μl、引物2.0μl、FTA卡打孔0.5mm、 Gold Taq 酶(5U/μl)0.16μl。PCR反应条件为96℃预变性2min；94℃ 5s，60℃ 70s，共27个循环后；60℃延伸30min，4℃保存备用。

1.3.2华夏TM白金PCR扩增试剂盒检测 华夏TM白金PCR扩增试剂盒复合扩增Amelogenin基因座和22个STR基因座(D19S433，D5S818，D21S11，D18S51，D6S1043，D3S1358，D13S317，D7S820，D16S539，CSF1P0，Penta D，vWA，D8S1179，TPOX，Penta E，TH01，D12S391，D2S1338，FGA，D22S1045，D10S1248，D1S1656)。使用ABI 9700(金座)热循环仪，反应体系为10μl，含 PCR Reaction Mix 4.0μl、引物4.0μl、Prep-n-go 2.0μl，FTA卡打孔0.5mm。PCR反应条件为95℃预变性1min；94℃ 3s，59℃ 16s，65℃ 29s，共27个循环后；60℃延伸5min，4℃保存备用。

1.3.3结果判定 用ABI 3500分析仪进行毛细管电泳，通过GeneMapper ID -X 1.4 软件进行结果分析。检测结果通过计算亲权指数(paternity index,PI)、累积亲权指数(cumulative paternity index,CPI)， 遵循孟德尔遗传定律判定血样检材与被检母亲是否亲生关系。STR基因座出现3个等位基因荧光峰，峰值面积比值为1∶1∶1 时，或者出现两个等位基因荧光峰，峰值面积比为2∶1或1∶2 (或出现峰值面积未达到2∶1/1∶2，但<0.65或者>1.8)时，或者出现1 个峰且峰面积是相邻杂合子单峰峰面积3倍时，制定为三等位基因。

2 结果

2.1 Goldeneye 20A PCR扩增试剂盒的STR分型及鉴定结果

对被检母亲现场抽取的血样及其提供的血样检材进行常规亲子鉴定所用的Goldeneye 20A PCR扩增试剂盒进行扩增，扩增后STR分型。见表1。

血样检材STR分型结果显示：该血样检材包括D19S433在内的19个常染色体STR基因座的等位基因均可以从被检母亲中找到来源。但是D21S11和Penta D这两个基因座的STR分型出现异常，均出现了3个峰，为三等位基因(图1)。被检母亲的D21S11和Penta D这两个基因座的等位基因分型正常(图1)。通过与相应的Cadder进行比较结果显示(图2、图3)：D21S11和Penta D两个基因座出现的3个等位基因峰没有显著差别，与Cadder的峰位置能够完全对应，并且与被检母亲对应的峰位置相同，这就说明这两个位点的STR分型结果能够确定为三等位基因。

表1 Goldeneye 20A PCR扩增试剂盒基因座分型结果

图1 被检母亲和血样检材的Goldeneye 20A PCR扩增试剂盒STR分型结果

图2 Goldeneye 20A PCR扩增试剂盒D21S11基因座比对结果

图3 Goldeneye 20A PCR扩增试剂盒Penta D基因座比对结果

2.2 华夏TM白金PCR扩增试剂盒的STR分型及鉴定结果

为了确认Goldeneye 20A的STR得到的三等位基因的分型结果，被检母亲及血样检材通过华夏TM白金PCR扩增试剂盒扩增进行验证，以确保结果的准确性。扩增后STR分型结果见表2。

血样检材STR分型结果显示：该血样检材包括D3S1358在内的23个常染色体STR基因座的等位基因均可以从被检母亲中找到来源，与Goldeneye 20A PCR扩增试剂盒分型结果一致的是D21S11和Penta D这两个基因座的STR分型依然是存在3个等位基因峰(图4)。通过与相应的Cadder进行比较，结果也可以明显看出：D21S11和Penta D两个基因座出现的三个等位基因峰没有显著差别，峰的位置与Cadder能够对应，并且与被检母亲的对应峰位置也相同，再一次说明这两个位点的STR分型结果为三等位基因。见图5、6。

表2 华夏TM白金PCR扩增试剂盒基因座分型结果

图4 被检母亲和血样检材的华夏TM白金PCR扩增试剂盒STR分型结果

图5 华夏TM白金PCR扩增试剂盒D21S11基因座比对结果

图6 华夏TM白金PCR扩增试剂盒Penta D基因座比对结果

3 讨论

在本案件亲权关系鉴定过程中，被检母亲及其提供的新生儿血样(血样检材)通过Goldeneye 20A PCR扩增试剂盒进行扩增，STR分析的结果显示：血样检材各个基因座的等位基因均可以从被检母亲中找到来源，符合孟德尔遗传定律。

但是血样检材中的D21S11(28/29/30)和Penta D(12/13/14)这两个基因座的STR分型均出现了3个等位基因，并且D21S11和Penta D都位于第21号染色体。为了确认该结果，排除实验过程中操作引起分型异常，我们进一步用华夏白金试剂盒PCR扩增分型进行验证，结果显示：血样检材中D21S11和Penta D这两个基因座的STR分型依然出现了3个等位基因，除此之外的其他染色体上的位点STR分型均是正常的二等位基因，以此可以推断该血样检材来自21三体综合征患者。经过案情回访调查发现，该新生儿已经进行了染色体检查，共检测了50个核型，其中48个核型存在三条21号染色体(见图7)，这就进一步确证了该新生儿是21三体综合征患者。

图7 核型诊断结果

STR分型结果显示被检母亲的19个STR位点分型是正常的，另据被检母亲叙述，该新生儿父亲也没有21三体综合征的相关表现。一般情况下，来源于父亲减数分裂失败的染色体三体十分少见[7]，这说明了该新生儿的3条21号染色体可能是由于减数分裂时的21号染色单体分离失败导致的。由于并不能确认该新生儿的第3条21号染色体的来源，因此累计亲权指数的计算较为复杂，需多加注意[8]。

在亲权鉴定中，有时候会出现某一基因座有3个带型或者3个等位基因分型的STR结果，这一现象可能是由于拷贝数变化、染色体数目异常(18染色体三体，21染色体三体等)或者是引物的结合区发生突变导致的[9]，因此需要多个试剂盒进行扩增，并对多个试剂盒的检测结果进行综合判断，排除干扰因素，确认该STR分型结果。三带型基因座的三个峰高可能相同也可能不同，21三体样本检验中除出现3条带外，还可能出现2条或1条带[10]。出现3条带判型较易判别，而当出现2个峰，但峰面积之比为2∶1或出现1个峰且峰面积是相邻杂合子单峰峰面积3倍时，应注意排除本症。本文通过多位点STR复合扩增技术的两种试剂盒相互验证，确定21号染色体上的两个基因座D21S11和Penta D确实为三等位基因，并且结合已有的染色体核型检测结果确定该血样来自21三体综合征患者。

在亲权关系鉴定或个体识别过程中，如果出现三等位基因现象一定要非常重视，需要使用不同的扩增试剂盒和重复检测验证分型结果[11-12]，以排除污染和泳道渗漏等导致误判的问题。