酸敏感离子通道在大鼠低O2高CO2所致呼吸效应中的作用

李 丽 刘文彦 苗文静

（1济宁医学院药学院，山东 日照276826；2济宁医学院基础学院，山东 济宁272067；3日照市妇幼保健院，日照276826）

缺氧是呼吸的常见刺激因素，重度缺氧可损害呼吸中枢神经元，引起呼吸抑制［1］。酸敏感离子通道（acid sensingion channel，ASICs）为非电压门控的主要通道Na＋的通道，由细胞外酸化激活［2］。缺氧时无氧糖酵解增强，组织酸化，ASICs易被激活。已有研究表明，局灶性脑缺血缺氧后，脑室内注射ASICs阻断剂能明显减轻脑组织的缺氧性损害［3］。由此推测，ASICs可能是引起缺氧性细胞损害的重要原因，而ASICs阻断剂阿米洛利对此则具有保护作用。CO2可以间接通过H＋刺激中枢化学感受器引起呼吸兴奋，而ASICs则在细胞外液［H＋］升高时被激活，故ASICs也可能在CO2引起的呼吸兴奋效应中发挥作用。本文通过脑室内预先微注射阿米洛利，再给SD大鼠吸入低氧和高CO2气体，以膈肌肌电为指标，观察ASICs对大鼠缺氧性呼吸抑制及高CO2所致呼吸兴奋反应的影响。

1 材料和方法

1．1 实验动物

选用健康成年SD大鼠共40只，雌雄不拘，体重250～300g，由山东大学实验动物中心提供。

1．2 主要试剂

阿米洛利购自Sigma公司。

1．3 实验方法

健康成年SD大鼠随机分为生理盐水＋空气对照组（n＝8）、生理盐水＋低 O2组（n＝8）、生理盐水＋高CO2组（n＝8）、阿米洛利＋低O2组（n＝8）、阿米洛利＋高CO2组（n＝8）。动物经20%的乌拉坦以1000mg／kg的剂量腹腔注射麻醉后，分别行气管插管、双侧迷走神经分离并剪断、剑突下暴露膈肌并记录膈肌肌电等操作。将大鼠以先固定双耳、再固定门齿的顺序固定于脑立体定位仪中，且保持其头位水平。参照Paxinos和Watson的《鼠脑立体定位图谱》，以Bregma点向后1．0mm，中线旁开1．5mm处为穿刺点，通过微量进样器垂直进针3．5～4．0mm向侧脑室内缓慢并匀速的注射药物。

1．3．1 生理盐水＋空气对照组 先向其侧脑室内微注射生理盐水（10μl），再向其气管插管侧管内通入流量为200ml／min的空气，在微量注射药物前5min、注射药物即刻每5min以膈肌肌电监测1次呼吸，每次监测1min。

1．3．2 生理盐水＋低O2组 除向大鼠气管插管侧管内通入相同流量的纯氮气外，其余操作同生理盐水＋空气对照组。

1．3．3 生理盐水＋高CO2组 除向大鼠气管插管侧管通入相同流量的纯CO2气体外，其余操作同生理盐水＋空气对照组。

1．3．4 阿米洛利＋低O2组 除向大鼠侧脑室内微注射阿米洛利（10mM，10μl）外，其余操作同生理盐水＋低O2组。

1．3．5 阿米洛利＋高CO2组 除向大鼠侧脑室内微注射阿米洛利（10mM，10μl）外，其余操作同生理盐水＋高CO2组。手术操作结束后，待动物恢复30min后再进行侧脑室微注射。膈肌肌电呼吸的变化以吸气时程（inspiratory time，TI）、呼气时程（expiratory time，TE）、呼吸频率（respiratory frequency，RF）和吸气幅度（amplitude of inspiration，Amp）为指标经BL－420生物机能实验系统进行观察和分析。实验结束后，向脑室内注入20g／L美蓝溶液0．5μl，处死动物开颅取脑，100ml／L甲醛固定24h，切开鉴定药物注射部位，凡未注入侧脑室的动物结果弃去。

1．4 统计学方法

采用SPSS17．0分析软件进行统计学处理。

2 结果

2．1 阿米洛利对大鼠缺氧所致呼吸抑制效应的影响

生理盐水＋空气对照组大鼠，吸入空气前后呼吸无明显改变（P＞0．05）。脑室内预注射生理盐水对呼吸也未产生明显影响（P＞0．05）。生理盐水＋低O2组大鼠，缺氧即刻、缺氧后第10min、20min呼吸明显兴奋，即较缺氧前TI、TE明显缩短；RF明显增快；Amp明显增大（P＜0．01）。缺氧后30 min呼吸明显抑制，即较缺氧前TI明显变短；TE明显延长；RF明显减慢；AMP明显减小（P＜0．01）。阿米洛利＋低O2组大鼠，缺氧即刻、缺氧后第10min、20min呼吸效应与生理盐水＋低O2组动物无明显差异，但缺氧后30min较缺氧前TI明显缩短，TE明显延长，RF明显增快（P＜0．01），AMP较缺氧前无显著变化（P＞0．01），即在缺氧后30min呼吸尚未出现明显抑制。见表1、图1。

2．2 阿米洛利对大鼠高CO2所致呼吸兴奋效应的影响

生理盐水＋高CO2组大鼠，吸入CO21min内，呼吸表现出明显的兴奋。即较吸入CO2前TI、TE明显缩短；RF明显增快；Amp明显增大（P＜0．01）。阿米洛利＋高CO2组大鼠，吸入CO21min内，呼吸也表现出明显的兴奋，以（｜CO21－pre－CO2｜／pre－CO2×100%）计算在吸入 CO2后1min的TI、TE、RF、Amp的变化率，阿米洛利＋高CO2组呼吸的变化率明显低于生理盐水＋高CO2组（P＜0．01）。见表2、表3、图2。

表1 脑室内注射阿米洛利对大鼠缺氧性呼吸抑制的影响

图1 脑室内注射阿米洛利对缺氧性呼吸抑制的影响

表2 脑室内注射阿米洛利对气管插管侧管吸入纯CO2气体大鼠所致呼吸兴奋的影响

表3 脑室内注射阿米洛利对气管插管侧管吸入纯CO2气体大鼠所致呼吸反应变化率的影响

图2 脑室内注射阿米洛利对气管插管侧管吸入纯CO2大鼠所致呼吸兴奋的影响

3 讨论

3．1 阿米洛利对缺氧性呼吸抑制的保护作用

本文结果显示，缺氧后大鼠先表现为呼吸兴奋，缺氧后30min表现为明显的抑制。缺氧后呼吸兴奋的产生主要是刺激外周化学感受器所致，而缺氧后呼吸抑制效应则是由呼吸中枢神经元缺氧性损害所致。对于阿米洛利＋缺氧组动物，缺氧后30min较缺氧前尚未表现出明显的抑制，提示阿米洛利对缺氧性呼吸抑制有保护作用。Miyake等［4］研究表明，在培养的大鼠皮层神经元，缺氧可使ASICs亚型ASICα表达明显增多；将大鼠大脑中动脉闭塞后，大鼠皮层神经元表达ASICα也明显增多，提示ASICα与神经元的缺氧性损害有关。缺氧性呼吸抑制时，脑干孤束核、斜方体核等呼吸相关核团ASICα表达明显增多，提示ASICα是导致呼吸中枢神经元缺氧性损害，进而导致呼吸抑制的重要原因［5］。缺氧可引起组织酸化，进而诱导ASICα的开放，引起大量Na＋内流，导致细胞水肿，同时ASICα对Ca2＋也有较大通透性，加重细胞内钙超载，引起神经元坏死。因此，ASICα被认为是非谷氨酸依赖性钙毒性神经元损伤的主要参与者［6］。阿米洛利是ASICs非特异性阻断剂，因此能减弱ASICα引起的缺氧性损害，进而对缺氧性呼吸抑制发挥保护作用。

3．2 阿米洛利减弱高浓度CO2引起的呼吸兴奋作用

本文结果显示，吸入高浓度CO21min大鼠表现为呼吸兴奋。吸入高浓度CO2引起呼吸兴奋的效应可通过刺激外周化学感受器和中枢化学感受器两条途径发挥作用。脑室内注射阿米洛利后，减弱了由吸入高浓度CO2引起的呼吸兴奋作用，即减弱了刺激中枢化学感受器的作用，故吸入高浓度CO2刺激中枢化学感受器引起的呼吸兴奋效应可能与ASICs有关。宋娜娜等［7］研究表明，在下丘脑外侧区注射阿米洛利，再注射酸化的人工脑脊液能阻断注射酸化人工脑脊液引起的呼吸兴奋效应。脑室内预注射阿米洛利也能阻断脑室内注射酸化人工脑脊液引起的呼吸兴奋效应［8］。以上结果提示，ASICs是使中枢化学感受器受到刺激进而产生呼吸效应的关键通道，由于吸入高浓度CO2引起呼吸兴奋可通过刺激外周和中枢化学感受器两条途径发挥作用。因此，脑室内注射阿米洛利可阻断中枢化学感受器的作用，但刺激外周化学感受器的作用依然可以显现出来。因此，脑室内注射ASICs阻断剂阿米洛利不能完全阻断吸入高浓度CO2引起呼吸兴奋效应，只能减弱此效应。

综上所述，ASICs阻断剂阿米洛利既对缺氧性呼吸抑制有保护作用，也可以减弱吸入高浓度CO2引起的呼吸兴奋效应，提示ASICs在缺氧和高CO2引起的呼吸效应中具有重要的调节作用。在上述两种呼吸反应中，究竟是ASICs哪种亚型发挥作用，还需更为深入地研究。

［1］ 李丽，王超，张静．缺氧性呼吸抑制的中枢机制［J］．医学综述，2007，13（17）：1341－1343．

［2］ 李丽．酸敏感的离子通道研究［J］．中华生物医学工程杂志，2010，5（1）：79－82．

［3］ 杜芸兰，朱立菁，陆生地，等．酸敏感离子通道1α介导缺氧皮质神经元损 伤及相关机制的探讨［J］．中风与神经疾病杂志，2007，24（5）：516－519．

［4］ Miyake T，Nishiwaki A，Yasukawa T，et al．Possible implications of acid－sensing ion channels in ischemia－induced retinal injury in rats［J］．Jpn J Ophthalmol，2013，57（1）：120－125．

［5］ 李丽，刘文彦，刘莹．丹红注射液延迟缺氧性呼吸抑制的发生及其机制［J］．中国病理生理杂志，2014，30（6）：1123－1126．

［6］ 向军，唐宇平，蔡定芳．非谷氨酸依赖的钙毒性机制在急性脑缺血损伤中的 作用［J］．中国病理生理杂志，2010，26（6）：1224－1228．

［7］ 宋娜娜．中枢酸敏感离子通道对呼吸的调节及机制研究［D］．上海：复旦大学，2010．

［8］ 李丽，刘文彦，高波．酸敏感离子通道在中枢化学感受器呼吸调节中的作用［J］．中国病理生理杂志，2014，30（8）：1400－1403．