正交实验优化甲氨蝶呤囊泡的制备＊

张 波 王启平 王慧云 全先高 王盈盈 王 宁

（1济宁医学院基础学院，山东 济宁272067；2济宁任城区卫生监督所，济宁272100；3济宁医学院药学院，山东 日照276826）

非离子表面活性剂囊泡（noisome，以下简称囊泡），是由非离子表面活性剂和胆固醇构成的新型药物载体，其结构组成与脂质体相似，具有单层或多层结构，而且化学性质稳定，能降低药物的毒副作用，提高药物治疗效果，是一种很有发展前途的新型给药系统［1－3］。甲氨蝶呤（MTX）是常见的抗肿瘤化疗药物，但其毒副作用较大，有严重的肝、肾损害，骨髓抑制，肠道反应等。为提高甲氨蝶呤的抗癌疗效，降低其毒副作用，国内外学者已做了许多研究工作。如制备甲氨蝶呤脂质体、磁导向甲氨蝶呤缓释药物、甲氨蝶呤淀粉纳米粒等［4－6］。本文采用非离子表面活性剂和胆固醇作为包封甲氨蝶呤的膜材，选用L9（34）因素水平表，对甲氨蝶呤囊泡的制备工艺条件进行优化，确定最佳制备方案。报道如下。

1 实验部分

1．1 仪器

UV－2600紫外可见分光光度计（岛津公司）；RE－52AA旋转蒸发仪（上海嘉鹏科技有限公司）；PHSJ－4A酸度计（上海元析仪器有限公司 ）；KQ－600GDV医用超声波清洗器（河南巩义予华仪器有限公司）；透析袋（北京索莱宝科技有限公司）；电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）。

1．2 试剂

甲氨蝶呤（中国药品生物制品检定所）；司盘（Span）20、40、60、80（天津凯通化学试剂有限公司，均为分析纯）；胆固醇（天津科密欧化学试剂有限公司）；三氯甲烷（分析纯，国药集团试剂有限公司）；无水乙醇（分析纯，国药集团试剂有限公司）；其它试剂均为分析纯。

1．3 贮备液

配制一系列Span40浓度分别为0．10、0．12、0．14mol／L的溶液，以 VCHCl3∶VC2H5OH＝4∶1的混合溶剂配制。

0．10mol／L胆固醇溶液的配制 取9．67g胆固醇溶于上述混合溶剂中，再加混合溶剂定容至250ml。

PBS缓冲溶液的配制800ml去离子水中溶解8．0g NaCl、0．20g KCl、1．44g Na2HPO4、0．42g KH2PO4，用NaOH溶液调pH至7．4，再加水定容至1000ml。

1．4 实验方法

1．4．1 囊泡的制备 分别取0．10mol／L 20、40、60、80和0．10mol／L胆固醇4．0ml加入至100ml圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪于40～50℃水浴真空旋转蒸干有机溶剂，再加入5．0ml一定浓度的甲氨蝶呤溶液或5．0ml蒸馏水，超声40min，即制得载药囊泡或空白囊泡。

以Span40浓度、Span40和胆固醇的比例、药物浓度、超声时间为考察因素，每个因素各取3个水平进行优选，以包封率为指标进行试验，采用L9（34）正交实验设计。见表1。

表1 L9（34）因素和水平

1．4．2 标准曲线的建立 精密称取5．0mg甲氨蝶呤标准品溶于0．01mol／L的氢氧化钠溶液中，转置于50ml容量瓶中，用0．01mol／L的氢氧化钠溶液定容。分别取上述溶液2．0、4．0、6．0、8．0、10．0ml，置于50ml容量瓶中，用0．01mol／L的氢氧化钠溶液定容，得其浓度分别为4、8、12、16、20μg／ml。以0．01mol／L的氢氧化钠溶液作空白对照，在303nm处测定其吸光度。见图1。

由图1可见，在测定浓度范围内，甲氨蝶呤溶液的浓度C（μg／ml）与吸光度A之间存在良好的线性关系，其回归方程为：Y＝0．05397C－0．00307，R＝0．9999。

图1 甲氨蝶呤标准曲线图

1．4．3 包封率的测定 取2ml空白囊泡或载药囊泡溶液于透析袋中，在100ml pH＝7．4的PBS缓冲液中透析24h，取一定量的透析液，用紫外分光光度计测定其在303nm处的吸光度，扣除空白囊泡的吸收，即可算得包封率［4］。

2 结果与讨论

2．1 影响甲氨蝶呤囊泡包封率的研究

2．1．1 表面活性剂的影响 分别采用20、40、60、80制备甲氨蝶呤囊泡，考察不同表面活性剂对包封率的影响，其结果见图2。由Span40和胆固醇构成的囊泡对甲氨蝶呤的包封效果较好。见图2。

图2 Span种类对包封率的影响

2．1．2 Span40浓度的影响 分别采用不同浓度的Span40溶液，考察表面活性剂浓度对甲氨蝶呤囊泡包封率的影响。见表2。

表2 Span40浓度对包封率的影响

由表2可知，当Span40浓度为0．12mol／L时包封率最高。原因是在制备囊泡的过程中加入胆固醇一般可提高膜的稳定性，降低药物的通透性，提高包封率与载药量。胆固醇具有填充效应，它能填充在表面活性剂单体形成的分子空隙中，赋予双层膜一定的刚性［7］。

2．1．3 胆固醇用量的影响 固定Span40用量，改变胆固醇与Span40的比例来考察胆固醇用量对甲氨蝶呤囊泡包封率的影响（见表3）。由表3可知，当Span40∶CHOL＝4∶2时，包封效率较高。比例继续增加，包封率反而下降。原因是胆固醇是助表面活性剂，可以增加双分子层中脂质分子排列的紧密程度，起到稳定类脂质体的作用，有利于囊泡的形成，但过多的胆固醇分子插入双层膜增加了双分子层的不对称性，使药物泄漏概率增加，包封率反而下降［8］。

表3 胆固醇用量对包封率的影响

2．1．4 药物浓度的影响 改变加入甲氨蝶呤溶液的浓度，考察药物浓度对甲氨蝶呤囊泡包封率的影响。见表4。

表4 药物浓度对包封率的影响

由表4可知，当药物浓度在0．6g／L时，药物包封率达到最高。浓度较低时包封率随甲氨蝶呤浓度增加而上升，说明囊泡的包封容量是有限的。

2．1．5 超声时间的影响 固定其他制备条件，改变超声时间，考察超声时间对甲氨蝶呤包封率的影响。见表5。

表5 超声时间对包封率的影响

由表5可知，超声时间在40min时包封率较高。超声有利于药物的包封，但超声时间过长会打碎一些比较大的多室囊泡，使得包容药物的体积减小，同时囊泡打碎的过程中也有一些药物释放出来，造成包封率下降。

2．2 甲氨蝶呤囊泡制备最佳工艺确定

正交实验见表6，方差分析见表7。

表6 正交设计及结果

表7 正交实验方差分析

由表6可知，4个因素的级差大小顺序为D＞B＞C＞A，其中超声时间对甲氨蝶呤囊泡制备工艺影响最大，胆固醇用量影响较大，药物浓度和Span40浓度影响最小，由表6可见因素B（胆固醇用量）和因素D（超声时间）有显著性，因素 A（Span40浓度）和因素C（药物浓度）无显著性。即囊泡制备的最佳工艺条件为A2B2C2D2，即当司盘40浓度为0．12mol／L，司盘40∶CHOL为4∶2，药物浓度为0．6g／L，超声时间为40min时，药物的包封率达到最高。

2．3 最佳工艺验证试验

按优选的最佳工艺进行3次平行试验，得出甲氨蝶呤囊泡的平均包封率为62．09%。

3 结论

本文以司盘类非离子表面活性剂和胆固醇为主要原料，采用薄膜分散法制备甲氨蝶呤类脂囊泡，以包封率作为考察指标，通过L9（34）正交实验优选了甲氨蝶呤囊泡的制备工艺条件，确定了较优处方，实验结果显示优选得到的最佳制备工艺条件是可行的，为新型药物传输系统的研究提供一定的依据，适合进一步研究。

［1］ Lu B．Study on polymersome micelles and niosomes as the vehicle of medicational system［J］．Journal of Henan University（Medical Science），2008，27（1）：1－3．

［2］ Yang R，Wang X J．Progress of study on niosomes［J］．Chinese Journal of Pharmaceutics，2008，6（3）：124－129．

［3］ Manconi M，Sinico C，Valenti D，et al．Niosomes as carriers fort retinoin III．A study into the in vitro cutaneous delivery of resicle tretinoin［J］．Int J Pharm，2006，311（1）：11－19．

［4］ 杜美菊，凌翠霞，李娜，等．甲氨蝶呤的制备和体外释放性能研究［J］．应用化工，2005，34（12）：757－759．

［5］ Zhao X Y，Li H，Zhang B X，et al．Preparation and evaluation of non－ionic surfactant based vesicle as a new drug delivery system［J］．International Journal of Pharmaceutical Research，2007，34（6）：439－441．

［6］ Zhang W T，Huang Q B，Lin L F，et al．Determination of the entrapment efficiency of docetaxol liposome［J］．Chinese Journal of Hospital pharmacy，2008，28（14）：1179－1181．

［7］ 张波，王慧云，全先高．非离子表面活性剂囊泡作为头孢匹胺钠药物载体的研究［J］．济宁医学院学报，2011，34（4）：236－239

［8］ 袁悦，王红霞，刘岩，等．类脂囊泡作为5－氟尿嘧啶药物载体的研究［J］．分子科学学报，2010，12（6）：420－423．