死亡时间推断方法的研究进展

虢洪松综述 崔 文 审校

(济宁医学院法医学与医学检验学院 山东 济宁272067)

死亡时间(time of death)在法医学上是指机体死后经过时间或死后时间间隔(postmortem interval,PMI)，即检验尸体时距死亡发生时的时间间隔。死亡时间推断即推断死后经历或间隔时间，是法医学鉴定中需要解决的重要问题之一。传统方法是根据尸体变化(超生反应、尸温、尸斑等)、尸体昆虫等[1-3]来进行PMI推断,但易受到外界环境因素的影响,准确性不高。近年来,中外法医学者提出了许多新的研究方法及技术，本文就其中的傅立叶变换红外光谱技术(Fourier transform infrared，FTIR)、彗星试验、显微分光光度术,在死亡时间推断研究中的应用作一综述。

1 FTIR

FTIR主要由红外光源经准直后变成平行光出射，由探测器测量得到干涉图，经快速傅里叶变换后能迅速识别并分析出该能量所对应的物质的分子结构及含量。具有扫描速度快，分辨率高且不对组织损毁和产生化学变化等[4]优点，大量应用于组织细胞等复杂体系的研究。因此,FTIR可作为一种实用的技术用于死亡时间的推断。

黄平等[5]应用FTIR分析大鼠死后组织、人体离体组织随死亡时间推移的化学降解过程实验,结果表明，人体心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏皮质、骨骼肌、大脑皮质和大鼠光谱变化相似。随着时间的变化,大鼠组织、人离体组织的FTIR光谱主要吸收峰没有明显变化,但其峰强随着死亡时间增加呈现出3种不同的变化方式：增加、下降、稳定，且不同峰强比显示出了相似的时间变化趋势。大鼠肝组织、肾皮质、脾组织的峰强和峰强比变化比骨骼肌、心脏、肺脏的变化更为明显。在20℃下，死后24h内可观察到大鼠脾组织和肾皮质吸收峰变化，且有统计学意义(P<0.05);而在24h后才能观察到心脏、肺脏、骨峰强比的变化。故可认为脾组织和肾皮质适合早期PMI推断，心脏、肺组织、骨骼肌可用于晚期PMI推断。同样有研究表明[6]，脾和肾皮质光谱可以有效进行24h内早期PMI推断。另有学者[7-8]在20℃外界条件下，以心脏、肝组织、脾脏、肺组织、肾皮质、骨骼肌作为样本，观察死后FTIR光谱吸收峰在大鼠组织和人离体组织的变化。结果发现，在1238、1080、1396cm-1吸收峰下，大鼠在死后24h内其心脏、肺组织、骨骼肌可以观察到不同变化，但其他吸收峰在相邻死亡时间点变化很小，无法区分。在死后,大鼠的脾脏和肾组织自溶发生早、速度快，24h后脾脏和肾皮质吸收峰峰强及峰强比差别明显，72h后便可见组织液化发生，168h后组织固体成分无法提取，但在死后120h，可观察到脾和肾皮质吸收峰峰强平台期变化趋势缓慢，相邻死亡时间点不能区分，考虑可能是在死后晚期这些组织已处于完全溶解状态[9]。而心脏和骨骼肌组织在死后168h保持固体状态，故在死亡晚期，大鼠的心脏、肺组织、骨骼肌FTIR光谱下降趋势要比脾脏和肾组织明显，可考虑这3个器官进行晚期PMI推断[10]。虽然FTIR光谱可以检测不同组织及器官在死亡早期和晚期光谱学的变化,但由于离体组织和在体组织的客观环境条件存在很大差异，是否具有相似的拟合曲线方程及光谱的规律性变化，尚需进一步研究探讨。因此,在建立使用FTIR推断PMI的数据库时，不能仅用离体器官组织的样本数据，而应收集不同犯罪现场、不同死因及不同周围环境条件下的在体样本信息，这将是FTIR推断PMI的数据库建立的基础措施。

2 彗星试验

单细胞凝胶电泳技术(singlecell gel electrophoresis,SCGE),是Ostling等于1984年首次提出，由于细胞电泳形状与彗星颇似，又称彗星试验(comet assay)。它能直接检测并分析死后机体组织细胞DNA的降解情况。在碱性条件电泳后，已发生降解的细胞则形成彗星样的尾部，而未降解的DNA细胞呈无尾圆形荧光核心，即彗星头部。随着时间的延长DNA降解增多,彗星头逐渐变小,彗星尾逐渐增长。故通过测定“彗星样”细胞出现率(计数一定量细胞其中彗星样细胞所占的比例)、头半径、头面积、尾长度、尾矩、尾面积、头/尾DNA含量比例、Oliver矩等参数,可监测细胞核 DNA 降解变化趋势，对DNA降解程度进行定量分析[11]。

易少华等[12]用彗星试验检测大鼠死后脾细胞DNA降解变化，结果发现，彗星头和尾DNA含量、尾长度、尾面积、Oliver矩等参数与PMI呈线性相关关系。安妮等[13]在应用彗星试验对兔骨髓细胞核DNA降解变化的研究中，借助专业的计算机图像分析技术软件，对不同部位及不同死亡时间内骨髓有核细胞DNA降解进行检测，结果表明，处于不同部位骨髓有核细胞核DNA随死亡时间发生的不同程度的降解，其降解程度与死亡时间之间呈相关性。郑吉龙等[14]应用彗星试验研究小鼠器官细胞核中DNA降解变化与死亡时间的关系的实验中，测定小鼠在死后72h内不同时间点骨骼肌、心、肝、肾、脑细胞核内头DNA含量、头半径、尾DNA含量、尾长度、尾矩、Olive 矩、尾面积等8项参数的变化值。结果，在小鼠死亡72h内,彗星尾DNA含量、尾长度、尾矩、尾面积、Olive 矩都呈增加趋势,头DNA含量、头半径、头面积均呈下降趋势。实验结果同时表明，死后核DNA降解速率与组织来源有关，其中脑组织最早发生降解，然后依次为肝、肾、心和骨骼肌组织。同时对以上8个测量参数综合分析，发现肝组织与死后间隔时间的相关性较强，各参数近似呈直线相关，在回归分析中相关系数较高，因此，在应用DNA降解分析来推断PMI中，肝组织是较理想的器官。另外，在实验中发现，在同一条件下，同一参数的测量值在同一样本不同细胞之间具有差异，这表明，在相同组织内DNA降解程度在不同细胞之间也具有差异性，考虑可能与细胞之间环境细微差别有关。李晓娜等[15]在应用彗星试验研究兔牙髓细胞核DNA降解的实验中，通过对上述参数指标测定，也得出与郑吉龙等相一致的实验结果，同时并将每个参数的测量值进行了多项式运算，获得了更能体现DNA降解趋势的二项式回归方程,具有显著的统计学意义(P<0.001)。明绍利等[16]应用彗星试验研究在牙齿离体后72h内，牙髓细胞核DNA降解规律，实验结果发现，牙髓细胞核DNA彗星电泳的多个彗星参数(彗星头DNA、尾DNA、Olive尾矩等)与PMI之间呈线性关系。应用彗星试验推断PMI具有以下优势[17]：1)简捷迅速，从采样到结果分析的过程时间短,为现场勘察和大样本量分析提供了可能；2)灵敏度高,能有效测定每1.657×10-1kg中0.1个DNA的断裂；3)需要量少,每份样品一般只需1000个细胞；4)安全性高,无需放射性标记。因此，彗星试验将会成为推断死亡时间精确、客观的新方法。

3 显微分光光度测定技术

显微分光光度测定技术(microspectrophotometry)是根据某些物质分子对光波进行选择性吸收的原理，在显微镜下对样品中的微细结构内的化学物质进行测定的技术，因“显微镜”具有使样品图像放大，提高灵敏度的部分作用，故被分析的样品量可以非常低，能精确测定样本中的一个细胞,甚至核仁内的核酸、酶和其他极微量物质的含量。其中常用的测量方法有扫描测量法、单波长法、荧光光度法。目前,由于荧光光度法在测定细胞内的DNA、RNA、蛋白质、氨基酸和生物胺的相对含量中具有灵敏度高的优点，广泛应用于PMI推断的研究中[18]。2000年,Hiroshi Ikegaya[19]在对死后0～4d内大鼠的脑、肝、心、肾等器官中细胞色素c氧化酶(COX)的活性进行测定的实验中，发现COX活性的变化趋势与大鼠死亡时间呈相关性,其中COX在心、脑、肾中的活性相似,而远高于肝、肺组织,这与Anthony G等[20]及Rohdich F等[21]的研究结果相一致。因此,不同器官组织中的COX的活性高低可作为死亡时间推断参考指标。2008年,李伟等[22]通过测定不同死亡时间大鼠右心内血浆吸光度的变化趋势，结果发现血浆的吸光度与死亡时间呈正相关(P<0.01)。2009年,刘茜等[23]同样采用生物荧光发光法测定大鼠死后肌肉组织中微生物ATP含量,结果发现，微生物ATP的含量与死亡时间之间呈正相关,因而成为一个推断晚期PMI的参数,但受嗜尸性昆虫等外界不确定因素的影响准确性不高。2009年,日本学者Yosuke等[24]在应用显微分光光度术对死后72h内的21例尸体皮肤颜色研究观察中，发现其中31个颜色参数指标变化趋势与死亡时间呈相关性。另有学者[25]过显微分光光度术研究发现，死后72h内尸斑变化(色度、色泽等指标)与死亡时间具有相关性，这为早期PMI的推断提供了新思路。

4 流式细胞技术

流式细胞技术(flow cytometry,FCM)是利用流式细胞仪进行的一种单细胞高速准确定量分析和分选技术。通过测定RNA、DNA及细胞体积等参数,对细胞进行高纯度的分类。流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物。后来,DiNunnoticedN[26-27]、王慧君[28]应用FCM技术定量对死亡机体所具有的不完整DNA的细胞数目检测,并与完整DNA的细胞数目相比较,结果证实，随着死亡时间的延长，两者的百分比例升高,可作为PMI推断的依据。2003年,Valet G等[29]应用流式细胞技术结合图像分析系统，提高了细胞DNA含量测定的精确性,促进了应用该项技术进行PMI推断的发展。张伯旸等[30]应用流式细胞仪测定肝组织中含不完整DNA的细胞数所占百分比,来研究人体死后肝脏细胞DNA含量变化与死亡时间的关系及影响因素实验中，结果表明，随死亡时间的延长DNA含量逐渐增高,与死亡时间之间具有相关性。在两种高、低不同环境温度条件下,死后24～72h内人肝细胞DNA含量随死亡时间的延长逐渐增高,与死亡时间之间具有相关性。这与齐凤英等[31]应用FCM技术对死后不同时间大鼠的心、肾、肝等组织的DNA含量变化以及Cina[32]对死后人脾组织细胞DNA含量变化的研究结论相一致。然而,在使用流式细胞技术时,需将制作成单细胞悬液,单细胞悬液的细胞数不应少于10000个，并且只对完整的细胞分析,因此在死亡时间推断中的具有一定的局限性。

5 小结

PMI的推断历来是法医病理学研究的热点问题，尽管国内外法医学者提出了许多研究方法或学说，如根据超生反应检测、离子检测、酶检测、DNA降解程度检测等推断死亡时间，但这些方法在实际工作中的应用尚有较大距离，问题仍然没有很好地解决。需要我们继续深入研究。但是，仅靠某一指标进行死亡时间推断，其准确性不高且难以广泛应用。因此,应不断拓宽研究范围，综合多种影响因素的多参数综合推断死亡时间，提高其准确性[35]。

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