射频消融治疗心房颤动患者血浆中miR-328、miR-499、miR-1及miR-21的变化及对复律后复发的预测作用探讨

黄江伟 李招兵 蒋长荣 龚慧琴 李自立

（南华大学附属南华医院，湖南 衡阳 421002）

心房颤动（房颤）是最为常见的、持续性心律失常，且随着年龄的增加，房颤发生率将不断增加[1]。数据调查结果表明[2]：75岁以上人群房颤发生率可达到10.0%，其患病率与冠心病、高血压及心力衰竭等疾病存在紧密的联系。射频消融术是通过点对点的模式，通过加热使组织细胞坏死，达到肺静脉隔离，能有效地改善患者症状，延缓病情发展。但是，部分患者治疗过程中由于缺乏有效的预测方法，导致患者远期预后较差，复律后复发率较高[3-4]。微小RNA（miRNA）能调控转录水平后的基因翻译，其机制为结合信使RNA的3’端非翻译区进行调控。同时，miRNA与胚胎的发育、细胞增殖与分化存在紧密的联系[5-6]。但是，临床上房颤患者射频消融治疗时血浆中 miR-328、miR-499、miR-1 及 miR-21 的变化及对复律后复发的预测价值研究较少。因此，本研究以房颤患者为对象，探讨射频消融治疗房颤患者血浆中 miR-328、miR-499、miR-1 及 miR-21 的变化及对复律后复发的预测作用，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年5月至2020年1月房颤患者84例作为对象。纳入标准：（1）符合房颤诊断标准[7]，均经12导联心电图、动态心电图确诊；（2）符合射频消融治疗适应证，且患者均可耐受；（3）具有完整的基线资料与随访资料。排除标准：（1）合并血液系统疾病、精神异常或凝血功能异常者；（2）严重肝肾功能异常、恶性肿瘤或房颤消融术史者；（3）瓣膜病房颤、甲状腺功能亢进者。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 所有患者均行射频消融治疗，具体方法如下：患者均行利多卡因（山东华鲁制药有限公司，5mL:0.1g×5/盒）麻醉，于左侧股静脉进行常规穿刺，放入冠状静脉窦（CS）导管，并经右侧股静脉完成房间隔穿刺，常规送入Lasso环状标测导管、冷盐水灌注导管，采用Carto3标测系统完成三维重建，并有效地指导患者射频消融。射频消融术式为环双侧肺静脉前庭电隔离（CPVI）。根据患者情况设置相关参数：生理盐水[湖南科伦制药有限公司，500mL:4.5g（可立袋双阀）/袋]灌注速度为 17-30mL/min，后壁消融功率25W，其他部位消融功率为30-35W，温度设定为40-43℃，借助Smart Touch压力感知导管消融压力，并控制在10-25g。上述操作完毕后若房颤仍持续，行电复律。患者治疗完毕后静脉给予异丙肾上腺素（上海禾丰制药有限公司，2mL:1mg×2/盒）+三磷酸酰胺（ATP）（天津金耀集团湖北天药药业股份有限公司，2mL:20mg×10/盒），判断患者是否存在肺静脉外触发，对于异常患者行肺静脉外触发灶标测与消融。治疗后4周评估治疗效果，并完成12个月随访[8]。

1.2.2 检测方法 检测步骤：治疗前、治疗后4周采用实时荧光PCR法测定血浆中miR-328、miR-499、miR-1及miR-21水平，具体方法如下。（1）总RNA的提取。患者治疗前、治疗后4周取外周空腹血3mL，向采集的血液中加入200μL氯仿[九鼎化学（上海）科技有限公司，500mL/瓶]，15s振荡后进行15min离心，速度4500rpm。离心完毕后去除上清，加入预冷乙醇（新乡市先丰医药新材料有限公司，10mL/瓶）1mL，常温下干燥 7min；在 A260吸光值下完成总RNA测定。（2）检测。采用实时荧光PCR法测定血浆中 miR-328、miR-499、miR-1 及 miR-21水平，设置PCR参数：30℃下操作10min；42℃处理30min；99℃下处理 5min；5℃下处理 5 min，合计完成循环35个，最终10min延长，温度72℃。将最终获得的产物置于浓度为1.5%琼脂凝胶电泳，引物设计如下：①miR-328上游引物：5’-TCCATTTCTGTGCGTGGC-3’；下游引物：5’-GAAGGAATTCGGCCACCT-3’；②miR-499上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；下游引物：5’-AACGCTTCGAATTTGCGT-3’；③miR-1 上游引物：5’-GGAGCGTCCCTCCAAAAT-3’；下游引物：5’-GGCTGTTATACTTCTCATGG-3；④miR-21上游引物：5’-ATCCCAAGCCCA-CAGTCT-3’；下游引物：5’-TGGTCCATCAGC-CCATAA-3’。

1.3 观察指标

（1）一般资料。完善患者有关检查，统计患者一般资料，包括性别、年龄、病程、BMI、合并症等；（2）血浆 miR-328、miR-499、miR-1及 miR-21水平。记录并统计患者射频消融治疗前及治疗后血浆miR-328、miR-499、miR-1及miR-21水平；记录并统计复发与非复发患者血浆miR-328、miR-499、miR-1及miR-21水平；（3）预测价值。分析血浆miR-328、miR-499、miR-1及miR-21水平在复律后复发预测价值（包括：灵敏度、特异度）。

1.4 统计学分析

采用SPSS23.0软件处理，计数资料行χ2检验，采用n（%）表示，计量资料行t检验，采用±s表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 84例房颤患者的一般资料

84例房颤患者的一般资料见表1。

表1 84例房颤患者的一般资料

2.2 射频消融治疗房颤患者血浆miR-328、miR-499、miR-1及miR-21水平比较

房颤患者经射频消融治疗后症状得到明显改善，患者血浆 miR-328、miR-499、miR-1 及 miR-21水平均低于治疗前，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2 射频消融治疗房颤患者血浆miR-328、miR-499、miR-1及 miR-21 水平比较（±s，n=84）

表2 射频消融治疗房颤患者血浆miR-328、miR-499、miR-1及 miR-21 水平比较（±s，n=84）

治疗后治疗前t值P值miR-328 1.02±0.14 2.34±0.26 6.392<0.001 miR-499 1.43±0.23 2.51±0.28 5.036<0.001 miR-1 1.39±0.22 2.42±0.27 7.793<0.001 miR-21 1.31±0.20 2.31±0.21 6.351<0.001

2.3 复发与非复发患者血浆miR-328、miR-499、miR-1及miR-21水平比较

84例患者射频消融治疗后复律后复发患者21例，复发患者血浆 miR-328、miR-499、miR-1及miR-21水平均高于非复发患者，差异有统计学意义（P<0.05），见表 3。

表3 复发与非复发患者血浆miR-328、miR-499、miR-1及miR-21水平比较（±s）

表3 复发与非复发患者血浆miR-328、miR-499、miR-1及miR-21水平比较（±s）

复发非复发t值P值例数（n）21 63 miR-328 1.02±0.14 2.34±0.26 6.392<0.001 miR-499 1.43±0.23 2.51±0.28 5.036<0.001 miR-1 1.39±0.22 2.42±0.27 7.793<0.001 miR-21 1.31±0.20 2.31±0.21 6.351<0.001

2.4 血浆中 miR-328、miR-499、miR-1及miR-21在复律后复发预测价值

血浆中 miR-328、miR-499、miR-1 及 miR-21联合检测在复律后复发患者中的预测灵敏度高于单一 miR-328、miR-499、miR-1 及 miR-21，差异有统计学意义（P<0.05）；特异度低于单一miR-328、miR-499、miR-1及miR-21，差异有统计学意义（P<0.05），见表 4。

表4 血浆中miR-328、miR-499、miR-1及miR-21在复律后复发预测价值

3 讨论

射频消融是房颤患者中常用的治疗方法，具有手术时间短、X线曝光时间短、手术并发症发生率低等优点[9]。同时，射频消融治疗时安全性更好，组织渗透作用亦相对较强，能获得良好的治疗效果。但是，部分患者治疗过程中由于缺乏有效的预测指标，导致患者复发率较高。本研究中，房颤患者经射频消融治疗后症状得到明显改善，患者血浆miR-328、miR-499、miR-1及miR-21水平均低于治疗前（P<0.05），提示房颤患者采用射频消融治疗能降低血浆miR-328、miR-499、miR-1 及 miR-21 水平，利于患者恢复。miRNA是在线虫体内发现的一种具有高度进化保守型的非编码小RNA。作为较早发现的一种miRNA，在细胞中基因调控时发挥了重要的作用，亦可直接参与肿瘤的发生、发展。国内学者研究表明：经典的miRNA能通过碱基互补配对，与靶信使核糖核酸的3’端非编码区特异性的结合抑制miRNA的翻译[3]。本研究中，84例患者射频消融治疗复律后复发患者21例，复发患者血浆miR-328、miR-499、miR-1及miR-21水平均高于非复发患者（P<0.05），说明房颤复发患者病情加重，能引起血浆miR-328、miR-499、miR-1及miR-21水平升高，导致患者预后较差。既往研究表明：miR-328、miR-499、miR-1及miR-21能介导细胞的定向转移与趋化性，并激活淋巴细胞、内皮细胞、中性粒细胞、上皮细胞上相应的趋化因子受体。miR-328、miR-499、miR-1及miR-21在调节人体细胞的复制、遗传物质脱氧核糖核酸损伤修复、炎性细胞额产生及转移中发挥了重要的作用。同时，miR-328、miR-499、miR-1 及 miR-21能通过各种多功能蛋白、生长因子信号、受体分子参与细胞内周期进程的调控，能直接参与细胞DNA的复制起始和增殖。本研究中，血浆中miR-328、miR-499、miR-1及miR-21联合检测在复律后复发患者中的预测灵敏度高于单一miR-328、miR-499、miR-1 及 miR-21（P<0.05），说明血浆中 miR-328、miR-499、miR-1及miR-21水平联合检测用于射频消融治疗房颤患者中具有较高的预测灵敏度。

综上所述，房颤患者采用射频消融治疗能降低血浆中miR-328、miR-499、miR-1及miR-21水平，用于复律后复发中具有较高的预测价值，可指导临床治疗。