肿瘤坏死因子-α在椎间盘细胞凋亡中的作用

·综述·

肿瘤坏死因子-α在椎间盘细胞凋亡中的作用

王海莹， 丁文元

作者单位：050051石家庄, 河北医科大学第三医院，河北省骨科生物力学重点实验室

通信作者：丁文元dingwenyuanls@Sina.cn

【关键词】椎间盘； 肿瘤坏死因子α； 细胞凋亡

作者简介：王海莹(1988— )，硕士，医师

【中图分类号】R681.53【文献标志码】 A

DOI【】

Doi[24]Kohyama K, Saura R, lta M, el al. Intervertebral disc cell apoptosis by nitric oxide: biological understanding of intervertebral disc degeneration [J].Kobe J Med Sci, 2000, 46(6):283-295.

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收稿日期：(2014-01-08)

椎间盘退变是引起慢性下腰痛的重要原因[1]，引起椎间盘退变的具体原因目前还不清楚，但椎间盘细胞，特别是髓核细胞，对维持正常的椎间盘结构与功能具有重要作用[2]。髓核细胞增殖与凋亡平衡的破坏对椎间盘的退变起到了重要作用[3]。近年来，炎性细胞因子在椎间盘退变中作用备受关注[4]。Peng[5]研究发现，由炎症反应所产生的细胞因子对加速椎间盘退变起到了重要作用。但目前导致椎间盘细胞凋亡的原因和机制并不十分明确，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)超家族在椎间盘细胞凋亡中发挥了重要作用。其中，TNF-α是发现最早、研究较多的一种强有力的炎症因子。本文就TNF-α与椎间盘细胞，特别是髓核细胞凋亡的关系以及作用机制作一综述。

1TNF-α的来源及作用

1.1TNF-α的来源

1975年，Carswell等[6]在小鼠血清中发现了一种对肿瘤细胞具有杀伤作用并且能够导致肿瘤组织坏死的物质，称为TNF。TNF有2个亚型，分别为TNF-α和TNF-β。其中，TNF-α又称恶质素，是一种单核因子，它主要由活化的单核细胞和巨噬细胞产生，正常情况下，血浆中的TNF-α水平较低。Nerlich等[7]研究发现，退变的髓核和纤维环细胞发生了变化，并且具有了巨噬细胞的特点。秦海江等[8]发现体外培养的椎间盘细胞与巨噬细胞相比，细胞中的TNF-α水平接近，认为TNF-α首先是巨噬细胞产生。Burke等[9]及侯晓东等[10]发现软骨细胞能够产生TNF-α。王靖等[11]通过针刺兔的椎间盘，发现与未发生退变的椎间盘相比，退变椎间盘纤维环的某些区域产生了TNF-α。Onozawa等[12]利用蛋白质印迹法检测出在鼠髓核细胞中存在相对分子质量为17 000的TNF-α表达，并认为髓核细胞能分泌TNF-α。Shamji等[13]发现，TNF-α可使椎间盘细胞产生代谢性应激，导致代谢产物含量增加。对鼠背根神经元细胞凋亡的研究发现，髓核细胞分泌TNF-α是诱导自身凋亡的重要途径[14]。Yoshida等[15]通过针刺兔髓核法制作椎间盘退变模型时发现，在针刺髓核第1天时，髓核细胞就产生了TNF-α。通过以上学者的研究发现，椎间盘中的TNF-α主要由退变的髓核细胞和纤维软骨细胞分泌，而且这些细胞已经具有了类似单核细胞和巨噬细胞的功能。

1.2TNF-α的作用

正常情况下，血液中TNF-α水平很低，但对于维持机体内环境稳态、新陈代谢及免疫系统等方面具有重要作用。首先，TNF-α能借助机体免疫功能，对同一肿瘤产生直接和间接双重活性的抗癌效应；TNF-α能诱导产生多种免疫介质参与B细胞及T细胞免疫过程。其次，TNF-α参与整个炎症反应过程，增强中性粒细胞对血管内皮的黏附性；增进凝血因子及组织因子的活性。TNF-α还可与其他炎症因子组成庞大复杂的网络，它们之间相互作用、相互影响。

TNF-α的主要作用包括[16]：①上调基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)活性并促其基因表达；②促进其他细胞因子的表达，如白细胞介素-2(interleukin-2, IL-2)、环氧化酶-2(cycloxyenase-2, COX-2)和前列腺素-E2(prostaglandin E2, PGE2)等；③刺激细胞迁移以及改善内皮细胞通透性；④抑制胶原和蛋白多糖的合成；⑤引起炎症反应。

2TNF-α与其他炎症因子的关系

TNF-α对椎间盘的破坏作用不仅限于TNF-α自身对椎间盘细胞凋亡的诱导作用，各种炎症因子之间也存在相互协调、相互诱导的作用。TNF-α自身还可以表现出“正反馈”的效应[17]。有研究表明，TNF-α合成可显著促进其他炎症因子的表达，因此TNF-α又被称为“前炎症因子”、“始动因子”[18]。丁文元等[19]在早期退变的椎间盘组织中检测到包括TNF-α在内的前炎症因子。Moon等[20]应用TNF-α刺激人纤维环时，发现TNF-α具有上调肿瘤生长因子(tumor growth factor-β1, TGF-β1)、胰岛素样生长因子 (insulin-like growth factor-1, IGF-1)、IL-8、IL-6的作用。Ohba等[21]研究发现，TNF-α可诱导血管内皮细胞生长因子合成，进而诱导IL-6、IL-8等炎症因子产生，促进MMPs、纤溶酶、尿激酶等的合成，加速蛋白聚糖、Ⅱ型胶原的降解；而且对其自身的表达也有促进作用，形成类似“正反馈”机制的循环。Fujita等[22]发现，在髓核细胞中，TNF-α可以通过NF-κB途径增强脯氨酰羟化酶3的表达，当脯氨酰羟化酶3表达增多时，髓核细胞中的MMP-13、多配体蛋白聚糖4、COX-2、血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5表达增多。Wang等[23]发现，TNF-α可以通过上调多配体蛋白聚糖4的表达，增强髓核细胞血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5的活性，进而使蛋白聚糖降解增加，并且当加入TNF-α抑制剂后变得减弱。

IL-6、PGE2、一氧化氮属于“下游”炎症因子，TNF-α、IL-1β等炎症因子的增加可间接刺激其含量的增加。正常椎间盘具有一定抑制 IL-6、PGE2、一氧化氮等分泌的功能，过多的TNF-α、IL-1β可打破这一平衡，使IL-6、PGE2、一氧化氮等大量产生。IL-6可显著促进MMP的表达，破坏椎间盘中蛋白聚糖、Ⅱ型胶原的正常比例，使椎间盘髓核水分丢失，失去具有良好缓冲性能的“胶冻样”形态。虽然PGE2、NO含量对TNF-α、IL-1β的直接作用影响不大，但可通过炎症反应改变椎间盘环境(pH值、电解质、氧饱和度等)，巩固已有的退变[17]。

3TNF-α与椎间盘细胞凋亡

3.1TNF-α引起椎间盘细胞凋亡的信号转导通路

细胞凋亡是由基因控制的细胞自主性死亡过程。椎间盘细胞过度凋亡可能是导致椎间盘基质大分子改变的主要原因，也是造成椎间盘细胞减少的直接原因。研究表明，在退变椎间盘中，髓核细胞凋亡率可高达(61.3±24.5)%，而正常仅为(15.5±6.5)%[24]。在凋亡众多的诱发因素中,炎症因子有着重要地位[25-26]。TNF-α在炎症反应中是激活细胞因子级联反应中的主要介质，它在循环中较早出现并迅速达到高峰。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是细胞内的一类丝/苏氨酸蛋白激酶。研究证实，MAPKs转导通路存在于大多数细胞内，并对细胞生物学反应(如细胞增殖、分化、转化和凋亡等)的过程具有至关重要的作用[27]。MAPKs信号转导途径是细胞内多条信号通路的交汇点。目前已经发现有多条并行的MAPKs信号通路。应激刺激、生长因子、炎症因子和某些G蛋白耦联受体可激活p38MAPK和JNK/SAPK 2条转导途径，这2条途径通过连续的蛋白质磷酸化诱发瀑布式级联反应，从而通过p38MAPK和JNK/SAPK途径诱发细胞凋亡[28-30]。

在退变椎间盘中，存在着高于正常含量的TNF-α，有着p38MAPK和JNK/SAPK信号转导途径的激活条件。董振辉等[31]研究发现，髓核细胞中既有p38MAPK的表达又有JNK/SAPK的表达。它们的活化形式即P-p38MAPK和P-JNK/SAPK的表达，进一步试验证实TNF-α组中存在着P-p38MAPK和P-JNK/SAPK的表达，而其阻断组中未检测出P-p38MAPK和P-JNK/SAPK的表达，证明2条途径均可被外源性炎性因子所激活。在流式细胞仪检测凋亡和TUNEL法检测凋亡的结果中发现，在P-p38MAPK和P-JNK/SAPK高表达的TNF-α组中，细胞凋亡率亦高于阻断组及对照组(P<0.01)。可见，TNF-α可以通过p38MAPK和JNK/SAPK信号转导途径诱导髓核细胞的凋亡。

3.2TNF-α引起椎间盘细胞凋亡相关基因的表达

抗凋亡基因Bcl-2家族是一种重要的控制细胞凋亡的基因家族，具有调控细胞存活期的生物学效应，但并不影响细胞增殖周期。有研究发现细胞中Bax/Bcl-2似乎可以调控凋亡的发生[32]。

Tschoeke等[33]研究发现，TNF-α可能通过细胞内的某些机制使Bcl-2表达降低，从而开启加速椎间盘细胞凋亡的“开关”。由此推测TNF-α可能在引起椎间盘退变进而导致椎间盘突出的过程中起非常重要的作用。Takada等[34]在正常大鼠和人突出椎间盘中均发现有Fas受体及其配体的存在，而线粒体途径主要涉及Bax和Bcl-2表达程度的变化。TNF-α加速髓核细胞凋亡的机制可能是使Bax表达增强、Bcl-2表达降低，从而使Bcl-2/Bax比例降低，进而加速髓核细胞的凋亡。

上皮膜蛋白-1(epithelial membrane protein-1,EMP-1)基因首先在脑肿瘤中发现，认为其可能与肿瘤的形成有关,所以EMP-1又被称为肿瘤相关性膜蛋白。有研究发现EMP-1在另一些组织和细胞中有抑制细胞增殖和促进凋亡的作用。胡明等[35-36]研究表明，在EMP-1高表达的情况下,椎间盘细胞发生了超常的细胞凋亡。在介导凋亡的过程中，Caspase家族发挥了重要作用,其中Caspase-3是关键的执行分子,它在细胞内以及细胞间凋亡信号转导过程中起关键作用。

史红伟等[37]在利用TNF-α诱导大鼠髓核细胞凋亡的实验中发现，与对照组相比，诱导组EMP-1基因以及Caspase-3基因表达量明显增高,并且与TNF-α有浓度及时间依赖性。因此认为TNF-α具有诱导大鼠髓核细胞凋亡的作用，并且明显诱导EMP-1、Caspase-3促凋亡基因的高表达。

4针对TNF-α治疗的展望

目前，TNF-α的生物性拮抗剂主要有Abalimumab、Etanercept、Infliximab、Onercept等。Onda等[38]发现TNF-α抗体可部分缓解由于髓核突出所致的根性疼痛。Olmarker等[39]在动物实验中发现Iinfliximab具有减轻突出髓核所致的疼痛。Sasaki等[40]由大鼠实验得出TNF-α抗体能够缓解坐骨神经痛，且缓解效果明显。Karppinen等[41]首次通过临床试验得出，Infliximab具有减轻腰腿痛的作用。Shamji等[42]发现可溶性TNF受体Ⅱ能够显著抑制 TNF-α对椎间盘的影响。Olmarker[43]在椎间盘源性腰痛实验中发现，联合应用TNF-α与IL-1β 2种细胞因子抑制剂对神经传导速度的影响效果更明显。Studer等[44]发现p38MAPK 通路是 IL-1β、TNF-α等细胞因子介导产生IL-6、PGE2的重要途径，椎间盘中IL-6、PGE2含量在通过抑制p38MARK通路后明显减少。Caspase-3途径是IL-1β、TNF-α细胞因子介导椎间盘细胞凋亡的重要通路之一，烟酚胺可降低其表达，保留椎间盘中正常比例的Ⅱ型胶原、水分、蛋白多糖等[45]。

综上，虽然目前关于TNF-α的生物性拮抗剂研究很多，但大多只是研究其对于减轻疼痛、缓解症状的作用。对于TNF-α的生物性拮抗剂是否能减缓TNF-α引起的椎间盘细胞凋亡，目前鲜有报道。TNF-α的生物性拮抗剂的临床应用及作用机制还需大量的论证。

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(本文编辑张建芬)