二氢杨梅素通过抑制骨骼肌TCPTP改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗

陈 欣， 刘 双， 文 琴， 王 越， 邓杰文， 凌宏艳， 奉水东

(南华大学衡阳医学院1.公共卫生学院；2.基础医学院生理学教研室，湖南省衡阳市 421001)

近年来，随着经济社会的发展以及人们生活行为方式的转变，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的患病率逐年上升，其病因主要是胰岛素分泌不足,或胰岛素敏感性下降所引起的胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)[1]。蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase1B，PTP1B)是胰岛素信号通路中一个重要的负调控因子，可以降低胰岛素的敏感性[2]。T细胞蛋白酪氨酸磷酸酶(T cell protein tyrosine phosphatase，TCPTP)在PTP家族中与PTP1B相似度最高，普遍存在于成熟细胞和胚胎中。二氢杨梅素(dihydromyricetin，DMY)属黄酮类化合物，可以提高胰岛素的敏感性，改善IR[3]。研究证明，TCPTP可以抑制下丘脑AgRP/NPY神经元胰岛素信号传导，并且能抑制下游磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/Akt信号通路[4-6]，但DMY对TCPTP的影响目前尚未见文献报道。骨骼肌是糖代谢以及胰岛素作用最重要的外周靶器官，与IR密切相关[7]。本文旨在探究DMY改善T2DM大鼠胰岛素抵抗的机制。

1 材料和方法

1.1 试剂及仪器

二氢杨梅素(dihydromyricetin,DMY)购于张家界志诚生物科技有限公司；链脲佐菌素(streptozocin，STZ)购于北京博爱港生物技术有限公司；BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)、蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(protein serine threonine kinase,Akt)、磷酸化蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(phosphorylated protein serine threonine kinase，p-Akt)、磷脂酰肌醇3-激酶、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(phosphorylation of phosphatidylinositol 3′-kinase，p-PI3K)、TCPTP和β-actin抗体均购于上海碧云天生物技术有限公司；胰岛素试剂盒购于上海仁捷生物科技有限公司。-80 ℃超低温冰箱购于奥林巴斯生物公司；高速低温离心机购于其林贝尔生物公司；蛋白电泳转膜系统、电泳槽/转印槽购于美国Bio-Rad公司；血糖仪购于三诺生物传感股份有限公司。

1.2 实验动物及饲养

SD雄性大鼠22只7～8周龄，体质量(270±10)g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK(湘)2014-0011。实验前，先将大鼠在安静及清洁干燥的环境下适应性喂养1周，自然光照，温度(23±2)℃，相对湿度(50±10)%。

1.3 二氢杨梅素的配制

将双蒸水置于70 ℃的恒温水浴箱中加热，20 min后，将一定量的二氢杨梅素溶解在已经加热好的双蒸水中，并用玻璃棒搅拌均匀。

1.4 T2DM大鼠模型的建立及实验分组

将22只大鼠随机分成4组：正常对照组、DMY对照组，每组6只，2型糖尿病组、2型糖尿病DMY组，每组5只，DMY剂量为250 mg/kg，沿用Gheibi等[8]的方法进行造模，造模成功后用普通饲料喂养,直至实验结束。

1.5 检测各组大鼠体质量、血糖、胰岛素敏感指数

16周末，各组大鼠空腹过夜，称重后，用三诺血糖仪测空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)，用ELISA法测血胰岛素(fasting insulin，FINS)并计算胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index，ISI)，ISI=Ln[1/(FPG·FINS)][9]。

1.6 Western blot检测大鼠骨骼肌TCPTP、Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K和GLUT4的表达

16周末，用断颈法处死大鼠，立即分离其骨骼肌至预冷的RIPA裂解液中,在匀浆器中反复研磨后低温高速离心20 min取上清液，用BCA试剂盒进行蛋白定量分析。配制10%的SDS-PAGE胶进行电泳，转膜至PVDF膜上后，用5%的脱脂奶粉封闭2 h，用TBSB洗去封闭液，共3次，每次5 min。清洗完成后，将PVDF膜与稀释好的一抗TCPTP、Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K、GLUT4、β-actin，4 ℃孵育过夜。次日加入二抗室温孵育1 h,TBSB洗涤3次，每次5 min，显影，用Image J软件系统对蛋白条带灰度值进行分析。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 T2DM模型建立成功

在注射STZ后的第1、2、3、7天测量大鼠空腹状态下的尾静脉血，2型糖尿病组和2型糖尿病DMY组、大鼠空腹血糖≥16.7 mmol/L，且精神萎靡，活动次数减少，皮毛光泽度下降，并出现了多饮、多食、多尿等表现，提示T2DM模型建立成功。

2.2 各组大鼠体质量、血糖、胰岛素敏感指数的比较

与正常对照组比较，2型糖尿病组大鼠FBG和FINS水平显著升高，体质量和ISI显著降低；与2型糖尿病组比较，2型糖尿病DMY组FBG和FINS水平降低(P<0.05)，体质量和ISI显著升高(P<0.05；表1)；DMY可逆转T2DM大鼠上述指标改变，但DMY对正常大鼠上述指标无明显影响。表明DMY可增加T2DM大鼠体质量、降低血糖并改善胰岛素抵抗(表1)。

表1 各组大鼠体质量、血糖及胰岛素敏感指数比较

2.3 各组大鼠骨骼肌TCPTP表达的比较

与正常对照组比较，2型糖尿病组大鼠TCPTP表达水平显著升高；DMY可显著降低2型糖尿病组大鼠TCPTP表达，但DMY对正常大鼠TCPTP表达水平无显著影响(图1)。

图1 各组TCPTP相对表达量比较

2.4 各组大鼠p-Akt、p-PI3K、GLUT4的比较

与正常对照组比较，2型糖尿病组GLUT4、p-Akt和p-PI3K的表达水平均明显下降(P<0.05)；与2型糖尿病组比较，2型糖尿病DMY组p-Akt、p-PI3K、GLUT4的表达水平均显著上升(P<0.05)。正常对照组与DMY对照组之间上述指标均无统计学意义(P>0.05；图2)。

图2 各组大鼠蛋白相对表达量比较

3 讨 论

目前，市面上大多数降糖药物都有不同程度的不良反应[10-11]，因此，寻找相对安全、低不良反应的中草药正成为治疗T2DM的热点。

DMY是植物藤茶的主要成分，具有降血脂、降血糖、改善大鼠认知功能及IR等作用[12-13]。研究表明DMY可以通过激活AMPK-PGC-1α-Sirt3信号通路诱导自噬、抑制PPARg磷酸化[14]以及调节肠道菌群结构改善IR[15]。

T细胞蛋白酪氨酸磷酸酶(TCPTP)可以使胰岛素受体去磷酸化，并减弱外围胰岛素信号传导。Dodd等[16]实验证明，TCPTP的缺失可增强中枢神经系统瘦素和胰岛素敏感性，并且抑制下游PI3K/Akt信号通路，改善IR。

本文以7～8周龄SD雄性大鼠为对象，采用高糖高脂饮食联合STZ的方法成功建立了T2DM大鼠模型。通过观察大鼠的体质量、FBG、FINS、ISI及TCPTP、GLUT4、p-Akt、p-PI3K的表达水平，探究DMY改善T2DM大鼠骨骼肌IR的机制。结果显示DMY可以增加T2DM大鼠的体质量、降低血糖并改善IR，对正常大鼠无明显影响。与正常对照组比较，2型糖尿病组p-Akt、p-PI3K、GLUT4的表达水平显著降低，TCPTP表达水平显著升高；与2型糖尿病组比较,2型糖尿病DMY组大鼠p-Akt、p-PI3K、GLUT4的表达水平显著升高、TCPTP表达水平显著降低，但DMY对正常大鼠上述指标无显著影响。

综上所述，DMY可能通过抑制TCPTP的表达改善T2DM大鼠骨骼肌胰岛素抵抗，这为T2DM的防治提供了新的思路。