罗米司亭对血小板减少性紫癜小鼠BMNC中Notch信号以及PBMC中GATA-3和PD-1表达的影响

张 扬， 王文斌

(1.重庆市璧山区人民医院肿瘤血液科，重庆市402760；2.重庆医科大学附属第二医院海扶肿瘤中心，重庆市400010)

免疫性血小板减少性紫癜(immune thrombocytopenic purpura，ITP)是指以血小板减少为特征的出血性疾病，多发于小儿，严重影响患儿的生命健康和生活质量。罗米司亭作为新一代的血小板生成素受体激动剂可直接刺激血小板的生成，临床上用于治疗血小板减少症，但是关于其在血小板减少性紫癜中的研究较少。Notch信号通路具有调节巨核细胞生长、凋亡的作用，从而影响血小板的生成[1]。近年来研究发现转录因子结合蛋白-3(transfer factor binding protein-3，GATA-3)可通过调节免疫反应参与免疫性血小板减少的发生[2]。程序性细胞死亡受体-1(programmed death-1，PD-1)也是ITP的主要参与者，其水平与患者疗效有一定的关系[3]。本文探究罗米司亭对血小板减少性紫癜小鼠Notch信号、GATA-3和PD-1表达的影响，为临床治疗血小板减少性紫癜提供依据。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂(Sigma公司，美国)；抗血小板抗体(antiplatelet antibody，PAIg)、Western blot所需一抗、二抗(Abcam公司，美国)；罗米司亭注射液(安进公司，美国)；EDTA-Na2抗凝剂试管、全自动血液分析仪BC-3000 Plus(深圳迈瑞生物科技有限公司)；瑞氏染色液(温州市康泰生物公司)；T淋巴细胞活化剂PHA(BD Biosciences公司，美国)；Trizol试剂盒(Invitrogen公司，美国)；反转录试剂盒(Takara公司，日本)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量检测试剂盒和ECL化学发光检测试剂盒(阿斯本生物技术公司，中国)；骨髓单个核细胞(bone marrow monouclear cells，BMNC)(武汉普诺赛生命科技有限公司)。

1.2 分组及干预方法

48只SPF级Balb/C小鼠(体质量18～22 g)随机均分为对照组、ITP组和罗米司亭组。ITP组和罗米司亭组参考文献[4]方法进行ITP建模，腹腔注射PAIg 2 μg(溶解于200 μL磷酸盐缓冲溶液)，连续注射7天，当小鼠血小板计数下降至<50%初始值即建模成功。对照组腹腔注射等量的磷酸盐缓冲溶液。从第8天起，罗米司亭组皮下注射罗米司亭(安进公司，H20065432)2 μg/kg，连续14天。ITP组给予同等剂量的生理盐水皮下注射。

1.3 血小板计数

分别在建模前、建模第7天、干预第7天和干预第14天收集小鼠尾静脉血液于抗凝管中，使用全自动血液分析仪检测血小板计数。

1.4 BMNC和外周血单个核细胞的培养

将建模第21天BMNC在RPMI 1640培养基中培养，分别加入T淋巴细胞活化剂PHA和不加PHA培养48 h(37 ℃、5%CO2)，细胞含量调节至5×105个/mL待测。建模第21天抽取外周血，通过淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，同上培养。

1.5 qRT-PCR

将细胞在液氮保护下研磨并裂解，然后用Trizol法提取组织总RNA并溶解于DEPC水中。使用反转录试剂盒合成cDNA。反转录反应条件为37 ℃反应15 min，反转录酶失活条件为85 ℃反应15 s。用PCR试剂盒进行qRT-PCR实验检测BMNC中Notch1、Jagged1和PBMC中GATA-3 mRNA水平。95 ℃下激活DNA聚合酶5 min进行PCR，然后进行40个循环两步PCR(95 ℃10 s和60 ℃30 s)，最终延伸75 ℃ 10 min，保持在4 ℃。所有引物均获自Genewiz公司，使用2-ΔΔCT法分析mRNA表达。

1.6 Western blot检测BMNC中Notch1、Jagged1蛋白水平

使用Western blot检测BMNC中Notch1、Jagged1蛋白水平，细胞裂解后收集蛋白并通过蛋白定量方法绘制标准曲线以确定蛋白水平。10%聚丙烯酰胺电泳，聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜进行转膜并在室温下用5%无脂牛奶封闭2 h。加入一抗室温震荡2 h，4 ℃孵育过夜，加入二抗，室温下孵育1.5～2.0 h，使用ECL试剂进行化学发光检测，以GAPDH为内参。使用流式细胞术检测BMNC中PD-1水平。

1.7 统计学处理

2 结 果2.1 各组小鼠血小板计数的比较

与对照组比较，建模后小鼠血小板计数显著降低，干预第7天和14天罗米司亭组血小板计数显著高于ITP组，且随时间延长更为显著(P<0.05；表1)。

表1 各组小鼠血小板计数的比较 单位：×109个/L

2.2 各组Notch信号通路表达水平的比较

建模后BMNC中Notch信号通路表达水平显著升高(P<0.05)，罗米司亭组Notch、Jagged1蛋白和mRNA表达水平显著低于ITP组(P<0.05;图1和表2)。

图1 各组BMNC中Notch和Jagged1蛋白水平的比较

表2 各组BMNC中Notch信号通路表达水平的比较

2.3 各组GATA-3 mRNA和PD-1水平的比较

建模后小鼠PBMC中GATA-3 mRNA和PD-1水平显著降低(P<0.05)，罗米司亭组GATA-3 mRAN和PD-1水平显著高于ITP组(P<0.05；表3)。

表3 各组PBMC中GATA-3 mRNA和PD-1水平比较

3 讨 论

血小板减少性紫癜可分为继发性血小板减少性紫癜和免疫性血小板减少性紫癜，其中免疫性血小板减少是由于血小板抗体的存在而引起的血小板减少，其发病机制尚不明确。临床上一线用于治疗ITP的方法主要是通过抑制血小板抗体的生成来减少血小板破坏，常用的药物包括糖皮质激素等激素类药物和丙种球蛋白，以及环孢素、长春花碱、利妥昔单抗等化疗药物，但这些药物往往具有较多的不良反应，发现新的治疗ITP方法具有重要意义。

促进血小板的生成也是治疗血小板减少性紫癜的主要方法，血小板生成素模拟肽(thrombopoitinmimetic peptide，TMP)与血小板生成素(thrombopoietin，TPO)具有相似的生物学活性，具有促进局部细胞增殖、分化和促进血小板生成的作用。新一代的血小板生成素受体激动剂罗米司亭可直接与巨核细胞表面的TPO受体c-MPL结合并促进血小板的生成，从而治疗免疫性血小板减少性紫癜[5]。FDA在2008年批准将罗米司亭用于经糖皮质激素、免疫球蛋白以及脾切除治疗无效的成人慢性免疫性血小板减少症，但是对于其在ITP中的应用以及相关机制的研究较少[6]。为探究罗米司亭对血小板减少性紫癜的意义，本研究通过注射PAIg建立小鼠ITP模型，建模后小鼠皮下出现明显紫癜，出现行动迟缓、精神萎靡等症状，并通过检测血小板计数判断建模成功；并通过皮下注射罗米司亭进行干预。结果发现，建模后小鼠血小板计数显著降低，干预后7天和14天罗米司亭组血小板计数显著高于ITP组。这说明罗米司亭具有促进ITP小鼠血小板恢复的作用。过往研究发现罗米司亭可呈剂量依赖性促进血小板生成，治疗血小板减少和ITP[7-8]。

为进一步探究罗米司亭治疗ITP的机制，本研究检测了罗米司亭对BMNC中Notch信号通路，以及PBMC中GATA-3和PD-1水平的影响。血小板减少性紫癜的机制之一是血小板生成的减少，过往研究已经证明罗米司亭与c-MPL结合后可通过促进JAK2和STAT5磷酸化，促进巨核系集落生成细胞生长，从而促进血小板生成[9]。同时骨髓中巨核细胞的成熟障碍也是免疫性血小板减少性紫癜的发病原因之一，Notch信号通路一方面可以通过影响造血干/祖细胞水平影响巨核细胞分化调节血小板的生成，另一方面Notch信号通路的激活会激活CD4+T细胞生成从而引起免疫性血小板减少，过往研究已经发现ITP会引起Notch通路过表达引起免疫反应[10]。本研究结果发现，建模后小鼠BMNC中Notch信号通路表达水平显著上调，罗米司亭组Notch、Jagged1蛋白和mRNA表达水平显著低于ITP组，提示罗米司亭可能具有抑制Notch信号通路表达的作用，从而治疗免疫性血小板减少。另一方面，血小板的减少也与机体的免疫情况有关，研究显示，GATA-3作为一种锌指蛋白可通过调节白细胞介素4、5等转录调节机体Th1/Th2平衡，参与免疫性血小板减少[11]。PD-1作为一种免疫球蛋白发挥免疫抑制作用，在免疫性血小板减少患者中，PD-1水平会显著降低，从而引起过度炎症反应和自身免疫性疾病[12]。本研究结果显示，建模后小鼠GATA-3和PD-1水平显著降低，罗米司亭组GATA-3 mRAN和PD-1水平显著高于ITP组。罗米司亭具有免疫抑制的作用[13]。

综上所述，罗米司亭可提高ITP小鼠血小板计数，下调BMNC中Notch信号通路表达水平，上调PBMC中GATA-3和PD-1水平。关于罗米司亭对免疫性血小板减少性紫癜的作用及其机制还需要进一步研究。