虾青素对2型糖尿病大鼠视网膜病变的干预作用及机制研究

杨 倩，刘 媛，李威威

(保定市第一中心医院 1.眼三科，2.眼二科，河北 保定 071000)

糖尿病视网膜病变是2型糖尿病严重的微血管并发症，可导致视力永久性丧失[1]。近年来，伴随我国2型糖尿病发病率的增加，2型糖尿病视网膜病变的发病率也随之增加，已严重影响人们的健康及正常生活[2]。有研究表明[3]，糖尿病患者视网膜对高糖及低氧刺激敏感，进而诱发促血管生成和抑制血管生成的失衡，最终导致视网膜病变。目前，临床常用激光手术及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抑制剂治疗2型糖尿病视网膜病变，但二者均对视网膜神经细胞有一定伤害[4]。因此，研发伤害性较低的用于治疗2型糖尿病视网膜病变的药物具有重要意义。虾青素是唯一能通过血脑屏障的一种类胡萝卜素，广泛存在于自然界中[5]。相关研究表明[6-7]，虾青素具有较强的抗氧化作用，可以有效清除细胞内氧自由基，对心血管疾病、糖尿病等疾病的预防及治疗有一定作用。既往研究表明虾青素对糖尿病肾病有一定的保护作用[8]，可通过上调核因子E2相关因子和NAD(P)H醌氧化还原酶1(nicotinamide quinone oxidoreductase 1,NQO1)抑制高糖诱导的氧化应激反应，从而发挥其保护作用。但是对于2型糖尿病视网膜病变的作用还有待探讨，因此，本实验探讨虾青素对2型糖尿病大鼠视网膜病变的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD雄性大鼠70只，SPF级，8周龄，体重质量220～230 g，购自于北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2014-0008。适应性饲养1周。按照2006版《关于善待实验动物的指导性意见》对实验动物进行处理。

1.2 试剂与仪器

虾青素(HPLC≥98%，上海北诺生物科技有限公司)；链脲佐菌素(大连美仑生物技术有限公司)；活性氧(ROS)试剂盒、过氧化氢酶(CAT)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(上海奥陆生物科技有限公司)；VEGF抗体和色素上皮衍生因子(PEDF)抗体(美国abcam公司)；Tecan Freedom EVOlyzer®全自动酶免工作站(帝肯(上海)贸易有限公司)；日立7100全自动生化分析仪(广州东林生物科技有限公司)；DYCP-31C型电泳仪及配套电泳槽(北京六一公司)等。

1.3 模型构建[9]

70只雄性SD大鼠适应性饲养1周后，随机选取60只大鼠，采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ 30 mg/kg)并持续高糖高脂饲料饲养构建2型糖尿病大鼠模型。10只正常组大鼠给予普通饲料饲养。造模后第五天，检测各组大鼠血糖，若血糖>16.7 mmol/L则2型糖尿病大鼠造模成功。其中30只大鼠造模成功，30只大鼠造模失败，予以剔除。所有大鼠自由饮水、检测血糖，每2周进行一次眼底检查，2型糖尿病大鼠视网膜出现新生血管即2型糖尿病视网膜病变大鼠模型成功。将2型糖尿病视网膜病变造模成功的30只大鼠随机分为3组：模型组、低剂量实验组、高剂量实验组，每组各10只。低剂量实验组大鼠给予虾青素15 mg/kg灌胃处理，高剂量实验组大鼠给予虾青素30 mg/kg灌胃处理，给药剂量参照相关文献[2]。模型组及正常组大鼠均给予同等剂量生理盐水。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 视网膜组织HE染色 取每组10只大鼠左眼视网膜组织，行HE染色。采用腹腔注射戊巴比妥钠(0.3 g/100 g)麻醉大鼠并处死，摘取眼球浸入眼球固定液中固定，取视网膜组织，依次石蜡包埋、切片、脱蜡、水化，然后进行HE染色，观察视网膜组织病理变化。

1.4.2 视网膜组织中ROS、CAT和SOD水平检测 取每组10只大鼠右眼视网膜组织，研磨成组织匀浆，3 500 r/min离心15 min(离心半径8 cm)，取离心后上清液，-20 ℃冰箱中保存，待验。采用免疫沉淀法检测视网膜组织中ROS、CAT和SOD水平，实验步骤严格按照试剂盒说明书执行。

1.4.3 视网膜组织中PEDF和VEGF水平检测 用蛋白质免疫印迹法[10]检测视网膜组织中PEDF和VEGF水平。步骤如下：取实验1.4.2中组织匀浆至试管中，首先加入RIPA裂解液用于提取组织中总蛋白；而后用BCA蛋白定量试剂盒进行PEDF及VEGF定量检测。具体过程：80 V凝胶电泳15 min，电压增加至120 V，直至溴酚蓝跑出胶面；转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，滴加一抗，4 ℃环境下孵育过夜；滴加二抗，室温下孵育2 h；曝光显影，用Image J1.8.0软件分析实验结果。

1.5 统计方法

用SPSS 23.0统计软件进行数据分析，正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组视网膜组织病理变化

由图1可知，正常组大鼠视网膜组织结构清晰，内、外核层细胞排列规则，未见新生血管生成；模型组视网膜组织结构不清晰，神经纤维层伴水肿，内、外核层细胞排列疏松，有新生血管生成；低、高剂量实验组视网膜组织结构较清晰，内、外核层细胞排列较整齐，新生血管生成均较模型组有明显改善，且高剂量实验组改善效果优于低剂量实验组。

图1 各组视网膜组织病理切片(HE，40×)A：正常组；B：模型组；C：低剂量实验组；D：高剂量实验组

2.2 各组视网膜组织中ROS、CAT和SOD水平比较

四组视网膜组织中ROS、CAT和SOD水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。与正常组比较，模型组视网膜组织中ROS水平升高，CAT和SOD水平降低(P<0.05)。与模型组比较，低、高剂量实验组视网膜组织中ROS水平降低，CAT和SOD水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；此外，高剂量实验组ROS、CAT和SOD水平改善程度优于低剂量实验组(P<0.05)。见表1。

表1 四组ROS、CAT和SOD水平比较

2.3 各组视网膜组织中PEDF和VEGF水平比较

由表2、图2可知，四组视网膜组织中PEDF和VEGF水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。与正常组比较，模型组视网膜组织中PEDF水平降低，VEGF水平升高(P<0.05)。与模型组比较，低、高剂量实验组视网膜组织中PEDF水平升高，VEGF水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。高剂量实验组视网膜组织中PEDF水平高于低剂量实验组(P<0.05)，VEGF水平低于低剂量实验组(P<0.05)。

表2 四组PEDF和VEGF水平比较

图2 四组PEDF和VEGF蛋白表达A：正常组；B：模型组；C：低剂量实验组；D：高剂量实验组

3 讨 论

糖尿病是由遗传、环境及生活方式等多种诱因引起的以高血糖为特征的代谢性疾病[11]。糖尿病还会产生的并发症有糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变等[12]。虾青素在糖尿病肾病中的保护作用已有研究，但是虾青素对于糖尿病视网膜病变的作用鲜有报道。本实验通过高糖高脂饲料饲养并腹腔注射链脲佐菌素构建2型糖尿病大鼠模型，通过观察虾青素干预后糖尿病大鼠视网膜组织病理变化、氧化应激及血管新生等相关指标，探究其对糖尿病视网膜病变的保护作用，为虾青素临床应用奠定基础。

本研究结果显示，模型组大鼠视网膜组织结构不清晰，神经纤维层伴水肿，内、外核层细胞排列疏松，有新生血管生成，该结果表明2型糖尿病视网膜病变大鼠模型造模成功。给予虾青素干预后，低、高剂量实验组视网膜组织结构及内、外核层细胞排列均较模型组有所改善，提示虾青素对2型糖尿病视网膜病变有较好的治疗作用，可修复高糖诱导的视网膜病变，且随虾青素给药剂量增加，其改善效果越为明显。

最近研究发现虾青素有较强的抗氧化能力[13-15]。ROS是脂质过氧化的终产物，检测ROS水平可了解膜脂过氧化的程度[16]。SOD同样能够反映细胞的氧化应激水平[17]。CAT是存在于机体内的一种重要的过氧化物分解酶，可使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，发挥保护细胞膜的结构和功能[18]。本研究结果显示：与正常组比较，模型组视网膜组织中ROS水平升高，CAT和SOD水平降低。给予虾青素干预后，低、高剂量实验组视网膜组织中ROS水平降低，CAT和SOD水平升高，该结果表明虾青素可有效改善高糖及低氧诱导的氧化应激损伤，提高组织内抗氧化应激酶CAT和SOD水平，发挥保护视网膜组织细胞免受氧化应激损伤。

PEDF是丝氨酸蛋白酶抑制剂超基因家族的成员，能够产生很强的新生血管抑制作用，同时是细胞外神经营养因子，对神经组织的发育和生长有重要作用[19]。糖尿病视网膜病变发病机制是视网膜缺血、缺氧造成眼内VEGF大量表达，VEGF会与高亲和力受体结合从而介导血管内皮细胞增殖，导致新生血管形成[20]。本研究给予虾青素干预后，低、高剂量实验组视网膜组织中PEDF水平升高，VEGF水平降低，且随虾青素给药剂量增加，其改善效果越明显。上述结果说明虾青素可有效通过上调PEDF表达，下调VEGF表达抑制视网膜新生血管生成，从而保护视网膜组织细胞免受损伤。

综上所述，虾青素可有效改善糖尿病大鼠视网膜病变，其机制可能与调控PEDF和VEGF表达，抗氧化应激有关。