牛初乳通过调节肠道菌群对小鼠溃疡性结肠炎的改善作用

郑慧怡，马芙蓉，罗晓清，张 瑜，金盈圻，贺庆芝

(1.南华大学衡阳医学院,湖南 衡阳 421001;2.桂林医学院生物技术学院,广西 桂林 541199)

炎症性肠病(inflammatory bowel diseases,IBD)是一种慢性炎性、特发性和复发性的胃肠道疾病。临床上，IBD主要包括克罗恩病(Crohn’s disease,CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)。虽然引起IBD的具体机制尚不十分清楚，但有人认为免疫、遗传和环境因素可能在疾病发病中起到很重要的作用[1]。在生理条件下，肠道共生菌群定植于胃肠道，对肠道黏膜屏障、代谢和免疫调节等功能发挥积极作用，同时一些病原微生物也能潜伏在肠道，对肠道构成一定威胁，因此，消化系统能够平衡共生菌和病原菌的免疫反应，以保持肠道稳态[2]。最近有文献报道，肠道菌群失调可以诱导肠道免疫应答的失调，最终导致肠炎的发生[3]。牛初乳(bovine colostrum,BC)是一种富含多种抗菌肽、生长因子和免疫调节因子的牛奶，对胃肠道的功能有着重要的保护作用[4]。牛初乳的功能主要体现在：提供必需的营养成分，加强自然防御系统，调节肠道菌群和免疫反应，促进组织的生长、成熟和修复[5]。牛初乳和牛初乳衍生产品已被用于预防和治疗多种胃肠道疾病[6]，但其具体调节机制尚不十分清楚。为了验证“牛初乳通过调节肠道菌群改善小鼠溃疡性结肠炎”这一推测，本研究拟用葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)构建C57BL/6J小鼠肠炎模型，监测其体重和肠炎评分的变化，同时应用HE染色及结肠组织病理评分观察牛初乳对小鼠肠炎的影响；实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,QPCR)监测肠道菌群中常见微生物的含量，初步探讨牛初乳抗溃疡性结肠炎的可能分子机制。该项目的完成可为肠炎的防治提供新的思路和手段。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

所有C57BL/6J小鼠均购于南京君科生物工程有限公司，牛初乳购自Qiagen公司，DSS购于美国MPBio公司，DNA提取试剂盒购于Qiagen公司，SYBR Green PCR试剂盒购于美国ABI公司，引物由上海生工合成。

1.2 实验方法

1.2.1 建立肠炎模型 将20只5～6周龄雌性C57BL/6J小鼠随机分为四组，即对照组(5只)、BC组(5只)、2%DSS组(5只)和BC+2%DSS组(5只)。BC组、BC+DSS组通过灌胃法每天接受含有牛初乳的悬浮液(牛初乳饲养量0.23 mg/g体重)，对照组、DSS组小鼠接受等体积的0.9%盐水溶液，持续21天。按照参考文献[7]的方法建立小鼠溃疡性结肠炎模型，即将葡聚糖硫酸钠(DSS，分子量为36 000～50 000)溶于蒸馏水中，配制成2%的DSS溶液；从牛初乳灌胃21天后开始连续给予DSS组、BC+DSS组小鼠7天2%DSS自由饮水，即可建立小鼠溃疡性结肠炎模型。

1.2.2 称重 从给予DSS前一天(D0)开始每天固定时间称量各组小鼠体重，以D0的体重为基数。

1.2.3 肠炎疾病活动指数(disease activity index,DAI)评估 从给予DSS前一天开始每天固定时间观察小鼠体重、粪便性状和便血情况，按照以下标准对小鼠进行评分，将小鼠体重、粪便性状和便血情况的评分相加即小鼠的DAI分值，以评估肠炎疾病的严重程度。评分标准如下：(1)体重改变评分标准(0～4分)：小鼠体重下降0%～1%被评为0分；下降1%～5%被评为1分；下降5%～10%被评为2分；下降10%～20%被评为3分；下降20%以上被评为4分。(2)粪便性状评分标准(0～4分)：正常粪便0分；软便1分；稀便2分；腹泻4分。(3)血便评分标准(0～4分)：正常粪便0分；粪便表面有血迹2分；严重出血4分。将以上3个分数相加即DAI的分值。

1.2.4 HE染色和结肠组织病理学评分(Histopathological score,HS) 取结肠组织并去除肠内容物后置于10%中性甲醛溶液中固定，循着包埋(石蜡)-切片-染色(HE)-脱水(酒精)-逐级脱水-透明(二甲苯)-封片(中性树胶)的步骤，最后在光镜下观察肠道黏膜充血、上皮细胞脱落坏死及炎症细胞浸润等病理变化，并按如下标准进行结肠组织病理评分：(1)溃疡评分标准(0～2分)：小鼠结肠组织中无溃疡被评为0分；有小溃疡(<3 mm)被评为1分；有大溃疡(>3 mm)被评为2分。(2)炎症评分标准(0～2分)：无炎症0分；轻度炎症1分；重度炎症2分。(3)肉芽肿评分标准(0～1分)：无肉芽肿0分；有肉芽肿1分。(4)病变深度评分标准(0～3分)：无病变0分；有病变且至黏膜下层1分；有病变且至肌层2分；有病变且至浆膜层3分。(5)纤维化评分标准(0～2分)：无纤维化0分；轻度纤维化1分；重度纤维化2分。将以上5个分数相加即病理学评分分值。

1.2.5 QPCR检测 实验结束后，按照Qiagen公司的DNA提取试剂盒提取粪便中的DNA,通过QPCR监测小鼠粪便中大肠杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌的DNA含量(引物[8-10]见表1)。QPCR反应体系：2×QPCR Mix 5.0 μL，引物工作液(2.5 μmol/L)0.8 μL，探针0.2 μL，DNA模版2.0 μL，ddH2O 2.0 μL，总体积10 μL，每个样本均做3复孔，QPCR扩增条件：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共40个循环。

表1 大肠杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌的基因引物

1.3 统计学处理

实验数据以均数±标准差表示，运用SPSS 17.0软件进行统计分析，均数之间的比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 牛初乳抑制DSS诱导的肠炎小鼠体重下降

对照组和BC组小鼠的体重平稳上升，两组差异无显著性(P>0.05)；DSS组小鼠的体重在第3天(D3)后呈现显著性降低的趋势，与对照组相比差异有显著性且差异持续增大，在第10天(D10)下降到最低值，体重下降了约23.5%；BC+DSS组小鼠的体重也在D3后呈现显著性降低的趋势，但在第8天(D8)下降到最低值，下降了约15%，并在之后的几天里体重呈现显著性增加的趋势，在第11天(D11)时接近给予DSS前一天时的体重。与DSS组比较，BC+DSS组在D8出现显著性差异且差异持续增大(P<0.01)；而与对照组相比，BC+DSS组在D8后差异显著性降低(P<0.01)。结果显示：牛初乳能抑制DSS诱导的肠炎小鼠体重下降(图1)。

图1 牛初乳对DSS诱导的肠炎小鼠体重的影响与DSS组比较，*P<0.01(注：BC为牛初乳；DSS为葡聚糖硫酸钠)

2.2 牛初乳降低DSS诱导的小鼠肠炎疾病评分

对照组和BC组小鼠没有发生肠炎，其疾病评分始终为0分；DSS组小鼠从给予DSS后第二天起肠炎评分不断上升，在第7天达到峰值约2.5分后有所下降并趋于稳定；BC+DSS组从第3天起小鼠肠炎评分不断上升，在第7天达到峰值2.3分，但从第8开始，小鼠肠炎评分呈显著性下降到接近对照组水平。结果显示(图2)：牛初乳降低DSS诱导的小鼠肠炎疾病评分。

图2 牛初乳对DSS诱导的小鼠肠炎疾病评分的影响与DSS组比较，*P<0.01(注：BC为牛初乳；DSS为葡聚糖硫酸钠)

2.3 牛初乳修复DSS诱导的小鼠结肠组织损伤

小鼠牛初乳灌胃21天后，给予2%DSS饮水，持续7天，HE染色结果显示(图3)：对照组和BC组小鼠结肠各层结构清晰，黏膜层肠腺丰富，排列规则，黏膜下层以及肌层未见明显异常；DSS组小鼠局部肠柱状上皮细胞点状坏死，胞核固缩深染(黑色箭头)，固有层肠腺减少消失，被肉芽组织取代，并伴有较多炎性细胞浸润(红色箭头)，中性粒细胞为主，损伤侵及黏膜下层，黏膜下层中也可见少量炎性细胞(黄色箭头)；BC+DSS组小鼠结肠组织结构基本完整，黏膜层中偶见小灶性的炎性细胞浸润，其余未见明显改变。结肠组织病理学评分结果(图4)：对照组和BC组均为0；DSS组[(6.05±1.03)分]与BC+DSS组[(1.33±0.54)分]比较，差异有显著性，P<0.01。牛初乳能显著性减轻DSS诱导的小鼠结肠炎症反应。

2.4 牛初乳改善DSS诱导的小鼠肠道菌群失调

实验结束后通过QPCR检测小鼠粪便中大肠杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌的DNA含量变化，结果显示(图5)：BC组小鼠肠道内大肠杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌含量与对照组比较，差异无显著性(P>0.05)；DSS组小鼠肠道内大肠杆菌含量较对照组显著性增加，而双歧杆菌和乳酸杆菌含量显著性减少(P<0.01)；BC预处理后再用DSS诱导的小鼠(即BC+DSS组)大肠杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌含量与DSS组比较，均显著性恢复，接近对照组及BC组的水平。牛初乳改善DSS诱导的小鼠肠道菌群失调。

3 讨 论

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种非特异性炎症性疾病，属于炎症性肠病的一种。病变部位多为乙状结肠和直肠，也可延伸至结肠，严重者蔓延到整个结肠。该病病程长，反复发作，若得不到及时的治疗，长期发展下去极易发生癌变[11]。调查发现，近年来其发病率逐年上升，虽然免疫抑制剂能在一定程度上控制部分患者的病情，但其价格昂贵且副作用强[12]。因此研究其发病与防治机制并寻找新的治疗手段是该病领域中急需解决的问题。

图3 牛初乳对DSS诱导的小鼠结肠炎症反应的影响(10×,HE)(注：BC为牛初乳；DSS为葡聚糖硫酸钠)

图4 牛初乳对DSS诱导的小鼠肠道组织病理学评分的影响与DSS组比较，*P<0.01(注：BC为牛初乳；DSS为葡聚糖硫酸钠)

图5 牛初乳对DSS诱导的小鼠肠道内大肠杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌的影响与DSS组比较，*P<0.01(注：BC为牛初乳；DSS为葡聚糖硫酸钠)

引起UC的致病因素极其复杂，至今尚不十分清楚。文献报道UC的发病可能与肠道菌群的异常反应、疾病进程中的环境因素以及遗传学倾向有关。正常情况下保护性免疫和肠道菌群之间的相互作用使肠道处于稳定平衡状态，即肠道稳态。各种原因引起的肠道菌群结构和功能变化(肠道菌群失调)，是导致肠道稳态被打破的重要原因之一，该稳态一旦被打破，会导致肠道功能失调，从而形成肠炎。Nishino K等人[13]证实，肠炎患者的肠道菌群失调，肠道内变形菌门细菌较正常人显著增多，但厚壁菌门和拟杆菌门细菌显著减少。

牛初乳(bovine colostrum,BC)是一种纯天然食品，是指在牛分娩一周内所产生的乳汁。牛初乳较普通乳汁除了能够提供更高含量的营养化学物质外，还含有许多特殊的生物活性成分，如免疫球蛋白、乳铁蛋白、乳过氧化物酶、生长因子、激素、细胞因子、脯氨酸多肽、溶菌酶等，这些生物活性物质是牛初乳的精华所在。牛初乳作为一种免疫调节剂，可减轻腹泻[14]，改善小鼠结肠炎[15]。口服牛初乳粉溶液，可以降低巨结肠大鼠模型发生肠炎的概率，且对巨结肠大鼠有预防肠炎发生的作用；牛初乳还可通过修复肠上皮损伤，降低炎症细胞因子和一氧化氮的表达，从而逆转慢性结肠炎[16]。且Filipescu IE等人[17]研究证实，BC给药耐受性良好，并不会引起健康小鼠体重的降低、肠炎疾病评分、肠组织炎性的损伤及肠道微生物的变化，因此可以确定BC的安全性和本实验结果的有效性。本研究前期结果发现牛初乳能够治疗小鼠溃疡性结肠炎，对DSS诱导的肠炎小鼠体重降低、肠炎疾病评分、肠组织炎性损伤等有显著性的修复改善作用，这与文献报道完全一致，证实了牛初乳可保护肠道、减轻肠道炎症程度。为了进一步探究牛初乳对小鼠溃疡性结肠炎的改善作用是否与调节肠道菌群有关，本课题组通过QPCR检测了肠道菌群中大肠杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌的含量。结果发现：DSS组(与对照组比较)小鼠肠道内大肠杆菌含量显著性增加，双歧杆菌和乳酸杆菌含量显著性减少；BC+DSS组(与DSS组比较)大肠杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌含量均显著性恢复，几乎接近对照组的水平。这证实牛初乳对小鼠溃疡性结肠炎的改善作用与调节肠道菌群有关。

综上所述，牛初乳对小鼠溃疡性结肠炎有一定的改善作用，其改善作用可能与肠道菌群有关，但由于牛初乳成分复杂，对小鼠溃疡性结肠炎的作用是多方面的，可能包括调节免疫应答、增强黏膜屏障功能等方面，目前尚不能用单一理论解释牛初乳对小鼠溃疡性结肠炎的作用机制，这还有待进一步研究及探讨。