核因子E2相关因子2在糖尿病肾病中的研究进展

沈 倩，王 利，赵 鼎SHEN Qian,WANG Li,ZHAO Ding

(1.盐城师范学院药学院，江苏 盐城 224002；2.上海中医药大学附属普陀医院肾内科，上海 200062；3.南京中医药大学附属盐城市中医院，江苏 盐城 224000)

糖尿病是世界性公共卫生问题，据国际糖尿病联盟发布的2017年统计数据显示，全球有4.25亿糖尿病患者，预计到2045年将达到7亿。糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的重要慢性微血管并发症，临床表现为蛋白尿、肾小球滤过率下降及肾功能减退等[1]。随着糖尿病发病率的升高，糖尿病肾病的患病率也呈逐年上升趋势，且成为终末期肾病的主要原因，严重影响患者的生活质量并增加社会的医疗负担。

目前DN的治疗方法主要包括控制血糖、血压、血脂水平，肾素-血管紧张素抑制剂的使用及生活方式的改变等，但疗效却不甚满意，因此寻求新的有效治疗方法对防治DN显得迫在眉睫。然而DN的发病机制复杂，对其研究仍在不断进展中，氧化应激作为重要的发病机制之一始终处于核心地位。转录因子核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)作为机体抗氧化应激过程的关键分子，近年来研究发现其在延缓DN进展中起着重要作用[2]，因此本文就Nrf2在糖尿病肾病中的研究作一综述。

1 Nrf2概述

1.1 Nrf2结构

Nrf2是CNC(cap‘n’collar)家族中转录活性最强的转录因子，具有碱性亮氨酸拉链结构(basic leucine zipper，bZIP)，含有 7个高度保守的Nrf2-ECH(Neh)同源结构域，即Neh1～Neh7[3]。Neh1包含基本的CNC-bZIP结构，可促进Nrf2向细胞核内转移，并与抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)结合，进而促进下游靶基因的转录。Neh2是一个高度保守的结构域，可参与胞浆中泛素-蛋白酶体介导的Nrf2降解，并能促使Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)结合，从而调控Nrf2活性。Neh3-Neh5是Nrf2的反式激活结构域，Neh3通过与染色质重构蛋白6作用来激活Nrf2，Neh4和Neh5通过与其它转录共激活因子结合启动Nrf2靶基因的转录。Neh6可与二聚体β转导子重复包含蛋白结合从而负调控Nrf2的转录活性。Neh7通过与视黄酸受体α结合，抑制Nrf2下游靶基因的表达。

1.2 Nrf2的分子调控机制

生理情况下，位于细胞质中的Keap1通过其Kelch重复结构域与Nrf2的Neh2结构域结合，将Nrf2定位于细胞质中，抑制其向细胞核内的转移，并介导Nrf2的泛素化降解，从而抑制Nrf2的活性。当细胞内发生氧化应激时，Keap1构象发生改变，与Nrf2解离，游离的Nrf2进入细胞核，在核内不断蓄积激活下游靶基因的转录，同时Keap1构象改变失去了对Nrf2的降解作用，使Nrf2处于活化状态。因此Keap1是Nrf2的负调控蛋白。

除Keap1外，细胞中还有多种蛋白激酶和蛋白分子，在氧化应激发生时被激活，不依赖于Keap1直接与Nrf2作用，使其发生磷酸化和构象改变，进而入核发挥转录活性。目前研究这些蛋白激酶主要包括蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)、酪氨酸蛋白激酶(Fyn)、酪蛋白激酶2相互作用蛋白-1(Casein kinase 2 interacting protein-1，CKIP-1)、沉默信息调节因子2相关酶1(sirtuin1，SIRT1)等[4]。不同的磷酸化位点对Nrf2有不同的效应，如PKC可使Nrf2上的Ser40发生磷酸化，从而激活Nrf2入核发挥转录活性；Fyn可使Nrf2上的Tyr568发生磷酸化，促使Nrf2出核从而抑制Nrf2活性[5]。

此外，研究表明micro RNA(miRNA)与长链非编码RNA(lncRNA)也参与Nrf2活性的调控，如在肾小管上皮细胞中，miR-29可通过抑制Keap1 mRNA表达，促进Nrf2泛素化而保护小管细胞[6]；MIAT作为lncRNA的代表，可通过维持细胞内Nrf2活化的稳定性而减少高糖诱导的肾小管上皮细胞的损伤[7]。总之，Nrf2的活性主要受Keap1和蛋白激酶的调控，miRNA和lncRNA对Nrf2的调控研究相对较少，尤其是lncRNA如何调控Nrf2，还有待进一步研究。

2 Nrf2在糖尿病肾病发病机制中的研究

DN发病机制主要与氧化应激及相关炎症和纤维化、糖脂代谢紊乱、肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)、线粒体功能障碍、遗传因素等有关。Nrf2作为重要的转录因子，通过多种途径参与DN的发生发展。

2.1 Nrf2与氧化应激及相关炎症和纤维化

氧化应激、炎症及纤维化是DN的重要发病机制，三者之间有密切联系，Nrf2作为重要的抗氧化酶，可通过多种途径参与机体抗氧化反应。首先，Jiang等[8]在DN患者的肾组织中观察到活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)增加及Nrf2水平升高。其次，在体内动物研究中，发现链脲佐菌素(STZ)诱导的1型DN小鼠，Nrf2(-/-)比Nrf2(+/+)小鼠有更高的ROS水平、DNA损害和更严重的肾脏病理损害；进一步发现激活SIRT1，从而激活Nrf2抗氧化通路，可减轻肾脏内氧化应激、炎症和纤维化水平。在2型DN小鼠中，Song等[9]通过下调miR-27a，直接减少miR-27a与Nrf2的结合，促进Nrf2的活化，进而抑制db/db小鼠肾组织内氧化应激和炎症反应。在体外研究中，发现激活Nrf2/ARE通路可减少细胞内ROS水平、抑制肿瘤坏死因子-α、白细胞介素等炎症因子和纤维连接蛋白、IV型胶原蛋白等纤维化蛋白的表达，从而改善高糖诱导的小管细胞、系膜细胞和内皮细胞损伤[10]，进一步发现Nrf2/ARE的激活受SIRT1、CKIP-1及Fyn的调控。可见，Nrf2在DN氧化应激、炎症及纤维化中研究广泛，多种途径均可通过调控Nrf2发挥作用，也说明Nrf2在DN中的重要性。

2.2 Nrf2与糖脂代谢紊乱

糖尿病状态下肾组织中糖代谢活跃，葡萄糖可经过一系列反应形成晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)，是造成肾脏损伤的重要病理因素。实验研究发现，糖尿病模型肾小球内有大量的脂质沉积，并与肾小球的病理损害程度相关，而特异性降脂治疗能逆转DN进展，因此糖脂代谢紊乱也是DN的重要发病机制之一。在STZ诱导的DN小鼠中发现，上调Nrf2可明显抑制AGEs生成和AGEs受体表达，从而改善DN小鼠的糖毒性损伤。同时，Cheng等[11]发现非诺贝特(一种有效的降脂药)改善1型和2型DN小鼠肾损伤是通过PI3K/Akt/GSK-3β/Fyn介导的Nrf2途径的激活来实现的。在棕榈酸酯(palmitate，PA)诱导的系膜细胞脂毒性研究中发现，激活Nrf2可抑制PA诱导的内质网应激及凋亡基因的表达，从而减轻PA诱导的系膜细胞脂毒性损伤[12]。

2.3 Nrf2与RAS

RAS是一个调节钠平衡、体液平衡和动脉血压的激素系统，所有的RAS成分在肾内均有表达：包括肾素、血管紧张素原(angiotensinogen，Agt)、血管紧张素1-7受体(MasR)、血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)、血管紧张素转换酶2(Ace2)。其中Agt主要在近端肾小管上皮细胞中表达，并经肾素转化为非活性Agt I，再经ACE转化为活性Agt II。在DN发病过程中，无论是早期还是晚期都有一系列血管活性物质参与，而肾内RAS的异常活跃，引起肾小球血流动力学紊乱，导致肾小球内高压、高滤过、高灌注，进一步引起肾小球损害和蛋白尿发生，促进DN的发展。Zhao等[13]在研究Nrf2对RAS基因表达的影响中，采用高糖诱导近端肾小管损伤模型，用siRNA或Nrf2抑制剂抑制Nrf2表达后，发现Agt、ACE基因转录减少，而Ace2、MasR基因表达则增加。说明Nrf2刺激肾脏内RAS基因的表达，从而调控肾内RAS及血流动力学，由此推测Nrf2抑制剂有可能作为RAS抑制剂，改善肾小管纤维化和肾小管萎缩。

2.4 Nrf2与线粒体功能障碍

线粒体是一种重要的细胞器，存在于大多数真核细胞中，是细胞氧化磷酸化发生的主要场所，通过三羧酸循环合成腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)，为细胞提供能量，维持细胞的正常功能。肾脏细胞内含有丰富的线粒体，线粒体是产生ROS的主要部位，而ROS是导致肾脏损害的重要因素，因此线粒体功能障碍在DN的发病中越来越受到重视。目前在肾脏中有关Nrf2与线粒体功能的研究相对较少，主要集中在线粒体自噬方面。Sun等[14]在db/db小鼠模型和高糖诱导的肾小球内皮细胞中，发现线粒体自噬缺乏，线粒体ROS生成增加、膜电位下降以及PINK、parkin蛋白表达减少，通过促进Nrf2核转录，激活Nrf2/ARE途径，可以增加PINK、parkin蛋白的表达，逆转线粒体功能。在db/db小鼠肾小管和高糖诱导的肾小管细胞中，也发现线粒体自噬缺乏及线粒体功能障碍，使用mitoQ(一种靶向线粒体的抗氧化剂)处理后，增加了Nrf2的转录活性及PINK、parkin蛋白的表达，减少小管细胞的凋亡；进一步用Nrf2 siRNA干预后阻断了mitoQ对线粒体自噬和小管损害的保护作用。说明Nrf2在线粒体自噬和线粒体功能方面起重要作用。

2.5 Nrf2与遗传易感性

近年来，遗传因素在DN的发病中倍受关注，临床中发现并非所有的糖尿病患者都会发生肾脏损害，遗传因素决定了机体对内环境紊乱有不同的反应，即在DN易感性方面有重要作用。目前对遗传易感性研究较多的是基因多态性。近期，吉林大学第二医院肾脏病研究组发现[15]，在中国东北地区的汉族人群中存在Nrf2 基因变异，包括rs2364723、rs10497511、rs1962142、rs6726395，并证实了其与糖尿病并发症有关。此外，在人类糖尿病肾脏中也观察到Nrf2信号失调。因此Nrf2 基因变异对糖尿病病人是否发展为DN可能起重要作用，但这方面的研究目前仍较欠缺，还有待进一步探索。

3 中药及其有效成分激活Nrf2在糖尿病肾病治疗中的研究

在DN的治疗中，除一般性治疗(控制血糖、饮食、运动及服用Agt II受体阻断剂)外，还有很多关于Nrf2激活剂的基础及临床研究，如萝卜硫素、白藜芦醇、锌、泛素蛋白酶体抑制剂等，其中研究最多的是甲基巴多索隆(bardoxolone methyl，BM)，并进入II期临床试验[16]。在试验过程中，BM能有效地改善肾小球滤过率，但却因严重的心血管事件而被迫终止。中药及其有效成分在DN的治疗研究已久，并具有可观的应用前景。

3.1 姜黄素

姜黄素是Nrf2激活剂在DN研究中最多的中药成分。作为姜黄根茎的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗癌、降低血脂、血糖的作用，尤其是抗氧化作用。Bo Hwan等[17]在2型DN模型大鼠中观察到，姜黄素可以通过上调Nrf2信号通路，有效改善蛋白尿、肾小球病理改变、尿丙二醛(Malonaldehyde，MDA)及超氧化物歧化酶水平，抑制氧化应激，保护肾小球。在体外研究中发现，姜黄素可抑制肾小管上皮细胞上皮-间质转分化，并与Nrf2蛋白的上调有关；用siRNA敲减Nrf2基因后姜黄素的抗纤维化作用减弱，说明姜黄素通过上调Nrf2发挥抗纤维化作用，从而保护小管细胞。Yang等[18]在2型DN患者中，给予姜黄素500 mg/d口服，治疗15～30天，结果发现姜黄素可明显减少尿微量白蛋白、血浆MDA水平，增加血淋巴细胞中Nrf2通路相关蛋白醌氧化还原酶(NAD(P)H quinone oxidoreductase 1，NQO-1)及其它抗氧化酶水平，并能减少血浆脂多糖含量、抑制淋巴细胞中相关炎症蛋白的表达，从而减缓DN的进展。由此可见，姜黄素通过激活Nrf2途径延缓DN的发展已有了一定的基础和临床研究，有望进一步进入临床试验阶段，并成为治疗DN的新药。

3.2 虎杖苷

虎杖苷是中药虎杖的主要活性成分，也称为白藜芦醇苷，药理研究具有抗炎、抗氧化等多种药理活性，临床上已被用于预防卒中、缺血/再灌注损伤及充血性心力衰竭等，在DN的治疗中也多有研究。Gong等[19]发现虎杖苷通过促进Nrf2/ARE抗氧化通路，抑制肾小球系膜细胞纤维化，进而改善DN大鼠肾功能，进一步研究发现，Nrf2的激活受CKIP-1的调控，即虎杖苷通过激活CKIP-1-Nrf2-ARE通路延缓糖尿病肾纤维化。此外虎杖苷还可通过Sirt1途径激活Nrf2/ARE通路，减轻肾小球系膜细胞氧化应激损伤，进一步发现虎杖苷可减少AGEs受体，从而增加Sirt1蛋白的表达和活性，并促进Nrf2靶基因的转录，最终抑制氧化应激损伤。因此，虎杖苷可能通过多种途径发挥抗氧化、抗炎作用，而Nrf2有可能是其作用的关键因子。

3.3 黄连素

黄连素是从植物黄连、黄柏中提取的生物碱，具有多种药理活性，如抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗纤维化作用等。研究表明，黄连素可通过减少转化生长因子-β表达，抑制细胞外基质沉积，改善糖尿病小鼠的肾功能，抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖。而近年来有关黄连素对肾小管细胞的保护作用受到格外关注，研究表明，黄连素通过抑制内质网应激和线粒体应激，保护肾小管细胞免于缺血/再灌注损伤，并能通过多种途径抑制氧化应激和纤维化。Zhang等[20]发现黄连素通过激活Nrf2途径改善DN小鼠的肾小管纤维化及高糖诱导的上皮-间质转分化，进一步用siRNA沉默Nrf2基因后，黄连素对Nrf2靶基因NQO1表达的诱导作用减弱，说明Nrf2是黄连素的作用靶点之一。此外，研究表明黄连素还可通过核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)途径抑制肾小管细胞炎症和纤维化。

目前研究的其它一些中药及中药成分，包括鸡血藤、杜仲、丹参酚酸A、三七皂苷、五味子素、黄芪甲苷等，均可通过激活Nrf2途径，抑制细胞氧化应激、炎症等反应，延缓DN的进展。虽然这些研究尚未进入临床试验阶段，但就目前研究进展来看具有十分可观的前景。

4 总 结

Nrf2作为细胞氧化应激反应中的关键分子，除维持细胞氧化还原平衡外，还参与细胞抗炎症、纤维化反应，改善糖脂代谢紊乱、RAS、线粒体功能，并与遗传易感性有关，目前已成为DN的研究热点之一。在DN的治疗方面，针对Nrf2通路已进行了基础及临床试验，但结果并不理想，而中药及中药成分则显示出明显的优越性，但仍需进行大量实验及临床验证以排除其严重的副作用，以期为DN的预防和治疗提供新的方法和思路。