慢性阻塞性肺疾病患者和肽素、高迁移率族蛋白1水平变化及其临床意义

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(西安市第九医院老年病一科,陕西西安 710054)

·慢性阻塞性肺病专题·

慢性阻塞性肺疾病患者和肽素、高迁移率族蛋白1水平变化及其临床意义

黄馨谅，白跳，崔莹雪，邵亚婷*

(西安市第九医院老年病一科,陕西西安 710054)

目的探讨慢性阻塞性肺疾病患者(COPD)中和肽素(Copeptin)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)水平变化及其临床意义。方法72例COPD患者，按病情分为轻度组(n=15)、中度组(n=28)、重度组(n=29)。分析各组患者Copeptin、HMGB1水平变化。结果随着病情由轻到重，患者血清Copeptin、HMGB1、白介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平和肺组织HMGB1 mRNA及其蛋白水平依次均显著升高。重度组患者住院天数均长于轻度、中度组。急性加重期患者血清Copeptin水平与住院天数呈正相关。结论COPD 患者的严重程度和Copeptin及HMGB1表达水平呈正相关， Copeptin及HMGB1表达水平均可作为临床上评价COPD 的严重程度的生物学指标。

慢性阻塞性肺疾病； 和肽素； 高迁移率族蛋白1； 白介素-1β； 肿瘤坏死因子-α

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是临床呼吸道重症疾病之一。持续存在的气流受限是COPD的只要特点，并且与气道慢性炎症反应的增高密切相关。目前大量研究表明，C 反应蛋白、降钙素原、血管升压素是COPD的非特异性生物学标志物，即在COPD 急性加重期时，上述生物学指标水平均明显升高，与疾病严重程度呈正相关[1-2]。和肽素(Copeptin)由39个氨基酸组成一种急性期时相蛋白，是精氨酸加压素(AVP)原的部分肽段，可由神经垂体分泌。正常人体中AVP含量极低，当机体出现感染、低血压等症状后可促使下丘脑分泌AVP增加。研究发现，大多心肺血管病患者血液中的AVP水平均明显升高，且和疾病程度呈正相关。然而，AVP的生物活性不稳定，难以测定，而Copeptin在体内表现比AVP更加稳定，无酶切位点和受体，在体内很少降解，可直接测定来反映AVP水平，因此，和肽素可作为一种新型的生物学标志物来诊断COPD[3-4]。近年有研究报道，高迁移率族蛋白1(High mobility group box-1 protein，HMGB1)在COPD的发病机制中起着重要作用[5]。HMGB1作为内毒素血症和脓毒症的晚期炎症介质，参与多种生理学进程，当其被释放到细胞外后，可作为细胞因子参与氧化应激调节、介导炎症反应，导致炎症反应进一步扩大。因此，HMGB1可作为致炎细胞因子网络中的中心环节，同时具有级联放大以及调节其他炎症因子分泌的功能，有研究亦提示HMGB1可能参与了COPD的发生和发展的过程[6]。本研究旨在探讨COPD 严重程度与Copeptin、 HMGB1在COPD发病过程中的水平变化情况，揭示HMGB1在COPD发病机制中的作用及临床意义。

1 资料与方法

1.1临床资料选择2015年1月～2016年10月于我院就诊的72例COPD患者作为研究对象。纳入标准：参照2007年《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》中的诊断标准进行确诊为COPD患者。排除标准：合并慢性感染性疾病、心肺功能障碍、恶性肿瘤者或者其他重大疾病患者；合并心理疾病、精神疾病患者。根据COPD 综合评估按病情由轻至重分为三组：轻度组(n=15) 、中度组(n=28) 、重度组(n=29)。轻度组15例，年龄19～53(41.8±3.5)岁；病程1.5～13(5.8±1.8)年。中度组28例，年龄20～53(41.8±3.5)岁；病程1.5～14(5.8±1.8)年。重度组29例，年龄19～54(41.8±3.5)岁；病程1.6～13(5.8±1.8)年。各组年龄、病程比较无明显差异，差异无统计学意义(P>0.05)，资料具有可比性。本研究获得医院伦理委员会批准，所有患者自愿签署知情同意书。

1.2主要仪器与试剂ABI 7300 荧光定量PCR仪(型号：ABI 7300，上海普迪生物技术有限公司)； EL204 梅特勒电子天平(型号：EL204，厂家：郑州南北仪器设备有限公司)；高迁移率族蛋白1(High mobility group protein 1，HMGB1)和GAPDH(内参)一抗均购自Cell Signaling Technology公司；二抗购自碧云天公司。

1.3 ELISA法检测指标采用ELISA试剂盒检测血清Copeptin、HMGB1，IL-1β和TNF-α水平，所有试剂盒均购自南京建成生物研究所。按照试剂盒操作严格进行测定。

1.4荧光定量PCR 采用Trizol方法提取肺组织总RNA，紫外分光光度计测定RNA纯度和浓度后，取2μg进行逆转录，生成cDNA。采用SYBR green染料法进行定量检测，利用Q-PCR仪设置95 ℃ 10 min预变性，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，扩增40个循环，每个循环记录一次CT值，根据2-ΔΔt计算HMGB1及GAPDHd的mRNA表达情况。HMGB1及GAPDH(内参)引物信息如下：

HMGB1：上游引物 (5′-3′) CATGGATCAGAAACTCAGCAAAGTC

下游引物 (5′-3′) CATGCCATGCCTTGTCTTTGCCTGC

GAPDH：上游引物 (5′-3′) CCTAGTTCGTCATGGGTGTGAACCA

下游引物 (5′-3′) GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC

1.5蛋白印迹(Western blot) 常规方法提取组织总蛋白，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)方法测定蛋白质含量后，进行凝胶电泳，每孔上样20 μg，电转至聚偏氟乙烯薄膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上后，3%的脱脂奶封闭2 h，分布孵育HMGB1和GAPDH一抗，4 ℃孵育一抗过夜，接着进行TBST洗膜，最后孵育二抗并进行显影。采用Quantityone软件对条带亮度进行分析。

2 结 果

2.1患者急性加重期与缓解期血清Copeptin水平与轻度组比较，中度，重度组患者急性加重期和缓解期的血清和肽素水平均升高，差异有统计学意义(P均<0.05)；与中度组比较，重度组患者急性加重期和缓解期的血清Copeptin水平均升高，差异有统计学意义(P均<0.05)；与缓解期比较，中度、重度组患者急性加重期血清Copeptin水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。具体见表1。

表1 急性加重期与缓解期血清Copeptin水平(pmol /L)

与轻度组比较，a：P<0.05；与中度组比较，b：P< 0.05；与缓解期期比较，c：P<0.05

2.2比较各组患者住院天数情况重度组患者住院天数均长于轻度、中度组，差异均有统计学意义(P均<0.05)，具体见表2。

表2 各组患者住院天数

与轻度组比较，a：P<0.05；与中度组比较，b：P<0.05

2.3血清Copeptin水平与住院天数的相关分析急性加重期患者血清Copeptin水平与住院天数呈正相关(r=0.617，P<0.01) ，具体见图1。

图1

2.4各组患者血清HMGB1、IL-1β和TNF-α水平与轻度组比较，中度，重度组患者血清HMGB1、IL-1β和TNF-α水平均升高，差异有统计学意义(P均<0.05)；与中度组比较，重度组患者血清HMGB1、IL-1β和TNF-α水平均升高，差异有统计学意义(P均<0.05)。具体见表3。

表3 各组患者血清HMGB1、IL-1β和TNF-α水平

与轻度组比较，a：P<0.05；与中度组比较，b：P<0.05

2.5各组患者肺组织HMGB1 mRNA和蛋白表达水平RT-PCR和Western blot法检测各组患者肺组织HMGB1 mRNA和蛋白表达水平，与轻度组比较，中度，重度组患者肺组织HMGB1 mRNA和蛋白表达水平均升高，差异有统计学意义(P均<0.05)；与中度组比较，重度组患者肺组织HMGB1 mRNA和蛋白表达水平均升高，差异有统计学意义(P均<0.05)；具体见表4和图2。

表4 肺组织HMGB1 mRNA和蛋白表达水平变化

与轻度组比较，a：P<0.05；与中度组比较，b：P<0.05

图2 HMGB1蛋白表达水平变化

3 讨 论

目前COPD患者急性加重期时不能完成肺功能全面检查，临床上关于COPD疾病严重程度的诊断主要是依靠患者呼吸困难、咳嗽、咳痰等临床症状的加重，故需要一个客观指标来评价COPD严重程度尤为重要。C反应蛋白、降钙素原、血管升压素是COPD的非特异性生物学标志物。有研究[7]对接受糖皮质激素治疗的急性加重期COPD患者血清C反应蛋白、Copeptin两项生物标志物水平进行比较，结果显示，C反应蛋白水平变化的波动和范围较大，C反应蛋白水平不仅与COPD患者疾病的严重程度有关，且还易受到糖皮质激素等药物的影响，而Copeptin水平的变化与这些药物的使用无关，仅与COPD 患者疾病的严重程度有关，故Copeptin在体内表现出更为稳定的生物活性，检测方法更为快捷简便，亦更能反应体内的炎症反应程度和疾病的严重程度。本研究结果表明，随着与COPD 患者疾病严重程度增加，患者血清Copeptin水平亦随着升高，提示COPD 患者的严重程度和Copeptin水平呈正相关。与缓解期比较，中度、重度组患者急性加重期血清Copeptin水平均升高，可能是由于在急性加重期，患者下呼吸道感染产生的炎症因子，细胞因子的刺激所致。重度组患者住院天数均长于轻度、中度组，急性加重期患者血清Copeptin水平与住院天数呈正相关(r=0.618，P<0.05)，提示Copeptin水平升高可引起住院时间延长，提示疾病的预后不理想。综上可知，COPD 患者的严重程度和Copeptin水平呈正相关，Copeptin有望成为评价COPD 的严重程度的生物学指标。

目前关于COPD的确切发病机制有多种假说，如蛋白酶和抗蛋白酶假说，免疫失衡假说，感染假说，氧化损伤假说及炎症假说等[8]。其中，炎症假说在COPD发生发展的机制一直备受学术研究者的重视。HMGB1由Johns在20 世纪60年代发现的一种急性期时相蛋白，因其在聚丙烯酚胺凝胶电泳中有很高的迁移率而得此名，随着HMGB1的发现，越来越多的学者对HMGB1进行研究[9-11]，结果表明，HMGB1在炎症反应的网络系统中可能作为一个中心环节，不仅自身的分泌有级联放大效应，而且还可以促进IL-1β、TNF-α等其他炎症因子的分泌。有报道[11]HMGB1在自身免疫性疾病等炎症性疾病的发病机制中起着非常重要的作用。本研究结果表明，随着与COPD 患者疾病严重程度增加，患者血清和肺组织中HMGB1基因和蛋白表达水平亦随着升高，提示COPD 患者的严重程度和HMGB1表达水平呈正相关。同时，随着患者血清中HMGB1基因和蛋白表达水平升高，血清炎症因子IL-1β和TNF-α水平亦随着升高，提示HMGB1有可能作为炎症因子在COPD 发生发展中起重要作用。

综上所述，COPD 患者的严重程度和Copeptin及HMGB1水平呈正相关，因此均可作为临床上评价COPD 的严重程度的生物学指标。

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ClinicalsignificanceofCopeptinandHMGB1inpatientswithchronicobstructivepulmonarydisease

HUANG Xinliang,BAI Tiao,CUI Yingxue,et al

(DepartmentofGeriatrics，NinthHospitalofXi’an，Xi’an,Shaanxi710054，China)

ObjectiveTo evaluate the clinical significance of Copeptin and HMGB1 in patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD).Methods72 patients with COPD in our hospital were analyzed,and divided into mild group (n=15),moderate group (n= 28),severe group (n= 29) according to COPD comprehensive evaluation by the disease from mild to severe.The levels of Copeptin and HMGB1 and the clinical significance of them in patients with COPD were evaluated.ResultsThe levels of serum Copeptin,HMGB1,IL-1β,TNF-α,tissue HMGB1 mRNA and protein were elevated with degree of COPD.Hospitalization days in severe group were statistically significantly longer than those of mild,moderate groups.The Copeptin levels and hospitalization days among patients with acute exacerbation had positive correlation.ConclusionThe severity of COPD was positively related to the levels of Copeptin and HMGB1.Therefore,which can be used as a biological indicator to evaluate the severity of COPD in clinic.

chronic obstructive pulmonary disease; copeptin; HMGB1; IL-1β; TNF-α

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.06.004

专题主持人——邵长周主任医师

2017-03-24；

2017-09-29

*通讯作者，E-mail：smcv8922@163.com.

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