丝裂霉素对胃癌细胞SGC-7901miRNA表达谱的影响

， ，，， ，，，

(1.南华大学医学院诊断学教研室，湖南 衡阳 421001；2.南华大学附属第二医院消化内科；3.南华大学附属第二医院药剂科)

·基础医学·

丝裂霉素对胃癌细胞SGC-7901miRNA表达谱的影响

谢娟1，唐霞2，李国庆2，刘艳萍2，李熠1，冯聚玲1，许丽芳1，王超3*

(1.南华大学医学院诊断学教研室，湖南 衡阳 421001；2.南华大学附属第二医院消化内科；3.南华大学附属第二医院药剂科)

目的分析丝裂霉素(MMC)治疗对胃癌细胞miRNA表达谱的影响，为MMC的胃癌治疗机制提供理论参考。方法体外培养胃癌SGC-7901细胞，根据噻唑兰(MTT)法评估MMC的作用效果和作用浓度；利用miRNA芯片技术评估MMC干预后SGC-7901的miRNA表达谱改变，并通过qRT-PCR验证差异表达miRNA。结果SGC-7901细胞生长抑制率与MMC作用浓度间存在正相关；MMC干预48 h后SGC-7901细胞有59个miRNA出现表达改变，与正常胃黏膜上皮细胞GES-1相比，SGC-7901胃癌细胞的miR-205*和miR-3924等11个miRNAs表达上调，而miR-498,miR-18b,miR-196b,miR-1247等22个miRNA表达下调；经MMC干预后，部分异常表达得到恢复。结论MMC可能调控miR-498在内的59个miRNA在胃癌细胞的表达。

丝裂霉素； MiRNA表达谱； 胃癌； SGC-7901

微小RNA(microRNA,miRNA) 是近年发现的一类非编码小分子RNA，可在转录后水平调控肿瘤相关基因的表达[1-2]。肿瘤细胞中miRNA的异常改变，可影响下游癌基因或抑癌基因的表达水平或功能，进而发挥促癌或抑癌作用[1]。研究证实miR-21可促进胃癌细胞的增殖及侵袭,miR-375作为肿瘤抑制因子可影响胃癌细胞的增殖，而miR-218在体内外模型均可抑制胃癌细胞的侵袭和转移[3-5]。肿瘤细胞经抗癌药物治疗后miRNA表达谱可随之改变[6]。丝裂霉素(MMC)参与的多种化疗药物的综合应用是治疗中晚期胃癌的重要手段之一[7]。张辉等[8]研究发现乳腺癌细胞经MMC作用后，miRNA表达谱发生了明显改变。目前胃癌细胞经过MMC作用后的miRNA表达谱尚无相关报道。本文初步探讨了MMC对胃癌细胞SGC-7901增殖的抑制功能，获得了与胃癌相关的miRNA表达谱及经MMC作用后改变的miRNA表达谱，这些结果可为后续胃癌的发生发展研究提供参考。

1 材料与方法

1.1细胞培养SGC-7901人胃癌细胞和正常人胃黏膜上皮细胞GES-1细胞(中国科学院，上海，中国)培养于RPMI-1640培养基(GIBCO，长岛，NY，USA)，另含2 mmol/L-谷氨酰胺(上海生工生物工程有限公司,上海，中国)，10%胎牛血清(HyClone,UT，USA)，50 U/mL青霉素和50 mg/链霉素。以密度为1×105个/mL铺于6孔培养板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育。当细胞融合达到50%后，换用新培养基培养过夜。给药前另用无血清RPMI-1640培养基(Sigma-Aldrich，上海，中国)孵育12 h。

1.2 MTT实验MTT测定法步骤参照制造商(Sigma-Aldrich，上海，中国)说明书。将5×104个/mL接种于96孔板，培养至细胞贴壁生长后弃去培养液，加入用不含血清培养液配制的不同浓度的MMC(0.187 μmol/L，0.374 μmol/L，0.748 μmol/L，1.496 μmol/L和2.991 μmol/L)，对照组细胞中为不加药物的无血清培养液，每组设5个复孔，空白对照组为不含细胞的等量溶剂。37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养4 h后，弃去上清，加入150 μL二甲基亚砜终止反应。采用酶联免疫仪(PerkinElmer,CA,USA)于570 nm波长测定每孔吸光度(A值)。生长抑制率计算公式为：生长抑制率(E)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。MMC作用48 h后的IC50浓度为抑制SGC-7901 细胞半数的浓度。

1.3基因芯片人胃癌细胞株SGC-7901经不同处理后加入1 mL TRIzol裂解液(Invitrogen,CA,USA)提取总RNA。待测RNA通过NanoDropTMfluorospectrometer(Thermo Scientific,Delaware,USA)在260 nm/280 nm处测得的OD值评估浓度和丰度，并通过1%变性琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整性。微RNA通过miRNA分离试剂盒(Invitrogen,CA,USA)收集，并采用miRCURYTMArray Power试剂盒(Exiqon,Denmark)将miRNA标记上HyTM荧光基团；在MAUI杂交系统(BioMicro,Salt Lake City,USA)，标记的miRNA与miRCURYTM芯片完成杂交。用Axon GenePix 4000B芯片扫描仪(AxonInstruments,Foster City,CA,USA)采集荧光强度，并使用GenePix pro V6.0软件(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)进行数据分析，上述基因芯片处理由上海康成生物工程有限公司协助完成。将各数据做标准化处理。计算相应miRNA分子的表达倍数(FC,Fold Change)，设FC≥2.0或≤0.5为差异表达标准。

1.4 qRT-PCR 总RNA采用逆转录试剂盒(PrimeScriptTMreagentkit，TaKaRa，Japan)逆转录为cDNA。采用的qRT-PCR反应液含0.5 μL 10 μmol/L的PCR特异性引物，0.5 μL的2×Master Mix，5 μL的10 μmol/L的PCR特异性引物，加水至总体积为8 μL；混合后加到384-PCR板，并加入2 μL cDNA；于Realtime PCR仪(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany),95 ℃下预变性10 min，随后的40个PCR循环如下：95 ℃，10 s；60 ℃，60 s。扩增反应结束后，从60 ℃缓慢加热到99 ℃生成熔解曲线。目的miRNA和内参(U6)的数据采用2- △△CT法计算。ΔΔCT=ΔCT SGC-7901(MMC干预后)-ΔCT SGC-7901，ΔCT=CT miRNA-CT U6。Ct是反应时荧光强度达到设定阈值所经过的扩增循环数。见表1。

表1 qRT-PCR引物表

1.5统计学分析统计学分析处理软件为统计学软件版本SPSS13.0 (SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)，所得到的计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差(ANOVA)分析以及采用LSD法行两两比较，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MMC抑制胃癌细胞SGC-7901的活性MTT实验表明0.187、0.374、0.748、1.496、 2.991 μmol/L MMC对胃癌细胞株SGC-7901的增殖抑制率分别为(21.3±1.5)%、(27.3±1.6)%、(45.3±1.5)%、(54.5±0.5)%和(63±0.1)%。随着MMC作用浓度的升高，SGC-7901的增殖抑制率也随之增高。MMC抑制SGC-7901增殖的IC50值为1.33 μmol/L(图1)。

图1 MMC 干预SGC-7901细胞48 h后细胞的存活情况与对照组比较，*：P<0.05

2.2 MMC调控SGC-7901的miRNA表达谱SGC-7901经过MMC干预后有60种miRNA出现差异表达,删去表达改变倍数绝对值小于1的miRNA [即log2(FC)<1]，尚包括38个显著上调的miRNA，21个显著下调的miRNA。与正常胃黏膜上皮细胞GES-1相比，SGC-7901胃癌细胞的miR-205*和miR-3924等11个miRNAs表达上调，而miR-498,miR-18b,miR-196b,miR-1247等22个miRNA表达下调，经MMC药物干预后，该异常表达可部分恢复(图2A)。此外，与GES-1相比较，在SGC-7901细胞中表达下调的miR-622,miR-7和miR-877等6个miRNAs，表达上调的miR-296-5p,miR-943和miR-1284等13个miRNAs的表达水平在MMC药物干预前后无明显变化(图2B)。而在SGC-7901细胞中表达无改变的miR-3926,miR-3074-3p和miR-H5-3P等7个miRNAs在经过MMC处理后，出现了表达的改变(图2C)。

2.3实时荧光定量qRT-PCR验证芯片结果将miRNA芯片检测结果与qRT-PCR 结果进行比较，与正常胃黏膜GES-1细胞相比，SGC-7901的miR-7、miR-185、miR-33b、miR-16的表达倍数在芯片结果中分别为0.24、0.215、0.275和2.288，在qRT-PCR结果中表达倍数分别为0.38、0.34、0.64和1.50。在MMC 干预的SGC-7901细胞中，miR-498 和miR-3924 的表达倍数在芯片结果中为13.067 和0.334，在qRT-PCR 结果中表达倍数分别为8.46 和0.38。qRT-PCR 结果与miRNA 芯片结果的趋势一致，进一步验证了芯片结果(图3)。

3 讨 论

相关研究已证实，miRNA的异常表达在胃癌的发生发展中发挥重要作用[9]。本文对比了SGC-7901胃癌细胞与GES-1正常胃黏膜细胞的miRNA表达谱，发现在SGC-7901细胞中miR-3924、miR-498和miR-1247等33个miRNA的表达存在异常；该结果包括了已报道的miR-205*，新成员如miR-498，但未包括已经报道的miR-221和miR-222等，这可能与胃癌机制的复杂易变性有关。

近年来，学者们对miRNA与化疗药物效应展开了相关研究。早期的研究大多集中在增强药物敏感性和对抗药物耐药性上。有报道在胃癌细胞系SGC-7901中发现miR-221 和miR-222 的表达明显上调，敲除其编码基因后可明显抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭，并增加对放化疗治疗的敏感性,其作用机制可能与调控PTEN基因有关[10]。Zhu等[11]研究发现miR-200bc/429可通过靶向调控BCL2和XIAP的表达在胃癌和肺癌细胞株对抗癌药物的多重耐药性中发挥重要作用。学者们又陆续通过研究发现抗癌药物能改变肿瘤细胞的miRNA表达谱，Shah MY等[12]研究报道MCF-7乳腺癌细胞经过5-FU处理后，出现了23个上调和19个下调的miRNA[12]。Zhou等[13]研究发现，结肠癌细胞HCT-8和HCT-116经5-氟尿嘧啶和奥沙利铂药物处理后，miRNA表达谱发生改变，在肿瘤细胞中高表达的miR-197，miR-191，miR-92a，miR-93，miR-222和miR-1826均出现了明显下调。

丝裂霉素作为治疗胃癌药物化疗中的手段之一，目前尚无报道其可影响胃癌细胞miRNA的表达谱。本文使用不同浓度的MMC处理胃癌细胞SGC-7901后，发现MMC可有效抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖，并且可显著影响胃癌细胞miRNA的表达。经MMC药物作用后，SGC-7901的miRNA表达谱出现59个miRNA的差异表达，其中38个显著上调，21个显著下调。此外，与正常胃黏膜上皮细胞相比，SGC-7901胃癌细胞的miR-205*和miR-3924等11个miRNAs表达上调，而miR-498,miR-18b,miR-196b,miR-1247等22个miRNA表达下调，在经过MMC药物干预后，部分异常表达得到恢复。其中miR-498是我们在本次研究中新发现的在胃癌中异常表达的新成员，此前在胃癌中并未见相关报道。目前，miR-498在其它肿瘤中异常表达的报道并不多，有研究发现miR-498在非小细胞性肺癌、结直肠腺癌中低表达[14-15]。而在乳腺癌中高表达[16]。本文结果显示miR-498在SGC-7901胃癌细胞中表达水平明显下调，经MMC作用后该异常表达可恢复；这提示miR-498可能参与了MMC的抑癌机制。本文采用的SGC-7901源自一位胃腺癌患者的淋巴结转移灶，为中度分化胃腺癌细胞,因结果重复性好被广泛应用；在进一步研究中，将继续在临床患者和其他肿瘤细胞系中验证上述结果。

图2 SGC-7901经MMC作用后miRNA的差异表达谱A：两个表达谱中改变趋势不同的miRNAs;B：两个表达谱中改变趋势相同的miRNAs；C：仅在经过MMC处理后在SGC-7901细胞中差异表达的miRNAs. 纵坐标为miRNA表达水平的Log2(FC)值，FC为miRNA的表达改变值

图3 qRT-PCR 验证miRNA芯片结果A：qRT-PCR 验证胃癌细胞系SGC-7901与正常胃黏膜上皮细胞GES-1比较的miRNA表达谱结果；B：qRT-PCR 验证SGC-7901经过MMC处理后，SGC-7901细胞的miRNA表达谱结果. 纵坐标为miRNA表达水平的改变倍数

总之，研究表明胃癌细胞中miRNA可出现异常表达，miR-498等miRNA在胃癌细胞内表达水平明显改变，而经MMC药物干预后，该异常表达水平可出现部分恢复，这提示MMC可能通过调控miR-498等miRNA的表达发挥抑癌作用。

[1] Lu J,Getz G,Miska EA,et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers[J].Nature,2005,435(7043):834-838.

[2] Ohtsuka M,Ling H,Doki Y,et al.MicroRNA Processing and Human Cancer[J].J Clin Med,2015,4(8):1651-1667.

[3] Tie J,Pan Y,Zhao L,et al.MiR-218 inhibits invasion and metastasis of gastric cancer by targeting the Robo1 receptor[J].PLoS Genet,2010,6(3):e1000879.

[4] Ding L,Xu Y,Zhang W,et al.MiR-375 frequently downregulated in gastric cancer inhibits cell proliferation by targeting JAK2[J].Cell Res,2010,20(7):784-793.

[5] Li L,Zhou L,Li Y,et al. MicroRNA-21 stimulates gastric cancer growth and invasion by inhibiting the tumor suppressor effects of programmed cell death protein 4 and phosphatase and tensin homolog [J]. J BUON,2014,19(1):228-236.

[6] Maushagen R,Pries R,Wollenberg B. Chemotherapy with paclitaxel leads to microRNA release[J]. HNO,2015,63(11):792-796.

[7] Kang YK,Chang HM,Yook JH,et al.Adjuvant chemotherapy for gastric cancer:a randomised phase 3 trial of mitomycin-C plus either short-term doxifluridine or long-term doxifluridine plus cisplatin after curative D2 gastrectomy (AMC0201)[J].Br J Cancer,2013,108(6):1245-1251.

[8] 张辉,苏式兵,周钱梅,等. 丝裂霉素对乳腺癌细胞microRNAs表达谱的影响[J].中国肿瘤,2010,19(2):131-134.

[9] Ueda T,Volinia S,Okumura H,et al.Relation between microRNA expression and progression and prognosis of gastric cancer:a microRNA expression analysis[J].Lancet Oncol,2010,11(2):136-146.

[10] Chun-Zhi Z,Lei H,An-Ling Z,et al. MicroRNA-221 and microRNA-222 regulate gastric carcinoma cell proliferation and radioresistance by targeting PTEN [J]. BMC Cancer,2010,10:367.

[11] Zhu W,Xu H,Zhu D,et al. miR-200bc/429 cluster modulates multidrug resistance of human cancer cell lines by targeting BCL2 and XIAP [J]. Cancer Chemother Pharmacol,2012,69(3):723-731.

[12] Shah MY,Pan X,Fix LN,et al.5-Fluorouracil drug alters the microRNA expression profiles in MCF-7 breast cancer cells[J].J Cell Physiol,2011,226(7):1868-1878.

[13] Zhou J,Zhou Y,Yin B,et al.5-Fluorouracil and oxaliplatin modify the expression profiles of microRNAs in human colon cancer cells in vitro[J].Oncol Rep,2010,23(1):121-128.

[14] Wang M,Zhang Q,Wang J,et al. MicroRNA-498 is downregulated in non-small cell lung cancer and correlates with tumor progression[J]. J Cancer Res Ther,2015,11(Suppl 1):C107-111.

[15] Gopalan V,Smith RA1,Lam AK. Downregulation of microRNA-498 in colorectal cancers and its cellular effects[J]. Exp Cell Res,2015,330(2):423-428.

[16] Matamala N,Vargas MT,González-Cámpora R,et al. MicroRNA deregulation in triple negative breast cancer reveals a role of miR-498 in regulating BRCA1 expression[J]. Oncotarget,2016,7(15):20068-20079.

MicroRNAprofilingofgastriccancerSGC-7901aftermitomycinCtreatment

XIE Juan,TANG Xia,LI Guoqing,et al

(DepartmentofDiagnostics,MedicalCollegeofUniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo evaluate the mitomycin C (MMC) treatment on the miRNA expression profile in gastric cancer cells,and provide the theoretical evidences for MMC treatment on gastric cancer.MethodsThe effects and optimum concentration of MMC were evaluated in the cultured SGC-7901 cells by MMT. The miRNA microarray technique was used for the exploration of miRNA profile of SGC-7901 cells after MMC treatment and the different expression of candidate miRNA was further confirmed by qRT-PCR.ResultsThe inhibition rate of SGC-7901 cells was negatively correlated with the MMC concentration. The 60 miRNAs have changed expression in SGC-7901 cells 48 hours after MMC treatment. Among them,11 miRNAs included miR-498 and miR-1247 were up-regulated,and miR-205*and miR-3924 were down-regulated. Some abnormal expression changes recovered after MMC treatment.ConclusionMMC can regulate the expression of 60 miRNAs including miR-498 in gastric cancer cells.

mitomycin; miRNA expression profile; gastric cancer; SGC-7901

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.02.005

2016-10-28；

2016-02-10

湖南省教育厅科学研究项目(16C1401)资助，湖南省教育厅优秀青年基金项目(13B098)资助.

*通讯作者，E-mail：317249741@qq.com.

R735.2

A

蒋湘莲)