肌萎缩侧索硬化症患者SQSTM1突变分析

林明星， 林婉挥， 刘昌云， 冯淑艳， 黄华品， 车春晖， 邹漳钰,4

肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是累及大脑皮层、脑干和脊髓神经元的神经变性疾病，以进行性肌无力、肌萎缩、肢体僵硬、腱反射亢进为主要临床表现，最终累及呼吸肌导致呼吸衰竭。患者的生存期多为3～5 a。大部分ALS为散发性，仅10%为家族性[1]。遗传学研究已发现20多种ALS相关的致病基因，比较常见的有SOD1、FUS、TARDBP及C9orf72[2]，而有关SQSTM1的报道相对较少。

SQSTM1编码泛素结合蛋白p62。研究表明，p62在蛋白酶体降解蛋白中扮演重要角色，通过与LC3/Atg8相互作用影响自噬形成。2011年，Fecto等[3]首先在ALS患者中检出SQSTM1突变，包括9例错义突变(其中8例被认为具有致病性)和1例缺失突变。此后在日本、中国、韩国的ALS患者中也陆续发现了SQSTM1突变[4-6]，然而亚洲人群中报道的样本量均较小。本研究旨在对1个较大的ALS样本中进行SQSTM1突变检测，并对SQSTM1基因突变的ALS患者的临床表型进行文献综述。

1 对象与方法

1.1 对象 收集2017年1月-2018年12月就诊于福建医科大学附属协和医院以及河南省人民医院神经内科的15例家族性ALS(familial amyotrophic lateral sclerosis，FALS)患者和275例散发性ALS(sporadic amyotrophic lateral sclerosis，SALS)患者，男性173例，女性117例，发病年龄(55.3±11.6)岁(43～67岁)。患者均符合El Escorial ALS的诊断标准[5](包括临床确诊、临床拟诊、实验室支持临床拟诊)。排除经检查发现其他可解释临床表现的疾病者。本研究经医院伦理委员会审批，在获得患者及家属知情同意后收集患者外周血进行后续检测。

1.2 方法

1.2.1SQSTM1突变检测 采用EDTA法提取外周血DNA，采用人血液基因组微型试剂盒(AxyPrep-96，美国Axygen公司)。通过基因捕获技术检测SQSTM1的8个外显子，具体方法参考文献[7]：目标区域捕获测序，使用DNA定量仪(Qubit 3.0，美国Thermo Fisher Scientific公司)定量基因组DNA。使用探针和panel(xGen Lockdown Probes、xGen Lockdown Panel，IDT，美国San Jose公司)进行捕获文库构建。文库使用Illumina通用接头序列，文库之间使用不同的Index进行区分。最终使用Illumina Hiseq平台(Illumina，美国San Diego公司)进行2×150 bp双末端测序，获得目标区域序列。突变位点筛查标准如下：(1)保留exonic和splicing点(Func.refGene列)；(2)保留质量值为PASS的点(qual列)；(3)保留1000genome、ESP6500、ExAC数据库频率<0.01的点(1000genome列、ESP6500列、ExAC03列)；(4)去除ClinVar中报道为良性或者可能良性的点(ClinVar列)；(5)去除InterVar中报道为良性或者可能良性的点(InterVar列)；(6))针对剪接的点，保留±3 bp以内的点，如c.1335+1T>C。另外先对FALS的先证者进行检测，若发现异常再对患者家属进行验证。

1.2.2 文献综述方法 在Pubmed、Medline、Web of Science数据库中检索摘要或者关键词中包含ALS和SQSTM1的所有文献，进一步筛选关于Human的临床研究。

2 结 果

2.1 基因检测结果 290例中，1例检测到SQSTM1已知杂合错义突变(c.923C>T，p.P308L)(图1A)，2例检测到SQSTM1杂合错义突变(c.653G>A，p.G218D和c.655G>A，p.A219T)(表1)。FALS先证者未发现SQSTM1突变。p.P308L的突变氨基酸位点在不同物种中具有高度保守性(图1B)，通过软件预测分析发现，该突变位点在1000genome数据库中出现的频率为0.001 0，在全外显子整合数据库(ExAC)中发生的频率为0.000 9；在错义突变蛋白的有害性分析软件(sortig intolerant from tolerant，SIFT)和PolyPhen-2软件中分别提示有害、可能有害；在预测基因突变效应软件(Mutation Taster)中提示致病；根据美国医学遗传学与基因组学学会(American Society for Medical Genetics and Genomics，ACMG)制定的标准提示致病(表1)。而p.G218D和p.A219T位点在SIFT、PolyPhen-2和Mutation Taster软件预测中均分别提示可忍受、良性、中性(表1)。

表1 SQSTM1突变表型特征

A：1例ALS患者出现SQSTM1突变位点(c.923C>T，p.P308L)，由脯氨酸错义突变为亮氨酸；B：该突变位点所在的氨基酸在不同物种中具有高度保守性。

2.2SQSTM1基因突变患者的临床表型SQSTM1基因p.P308L突变的患者为50岁男性，无家族史，以“进行性肢体无力、萎缩1 a”为主诉就诊。1 a前始出现右上肢肌力，9个月前出现左上肢无力，3个月前出现双下肢无力，无言语含糊、吞咽困难、饮水呛咳。就诊时查体右上肢肌力3+级，其余肢体肌力5-级，右上肢腱反射减弱，其余肢体腱反射正常，病理征阴性。发病后1 a，肌电图示右侧腋神经、肌皮神经复合肌肉动作电位(compound muscle action potential,CMAP)波幅降低，右侧正中神经运动传导速度波幅降低，右侧尺神经运动传导波幅正常低值，Erb刺激CMAP未见传导阻滞；左侧胸椎旁肌、双侧第一骨间肌、三角肌、右侧桡侧腕屈肌可见自发电位，运动单位动作电位(moto unit action potential,MUAP)时限增宽、波幅增高，大力收缩募集减少，右胸锁乳突肌和胫前肌未见自发电位，MUAP时限增宽、波幅增高，大力收缩募集正常，ALS功能评分量表(ALSFRS-R)为36分(总分48分)。就诊后患者服用利鲁唑(50 mg，bid)治疗，但症状进行性加重，逐渐出现吞咽困难、气喘，生存期约32个月。

2.3SQSTM1基因突变在ALS疾病中的临床研究及突变位点分布情况

2.3.1 文献检索结果 通过在Pubmed、Medline、Web of Science数据库中检索摘要或者关键词包含ALS和SQSTM1的文献，共133篇，进一步筛选关于Human且具有临床表型的临床研究文献，共14篇。

2.3.2SQSTM1基因突变在ALS疾病中的临床研究现状SQSTM1与ALS的相关性研究最早源于2011年美国的一项研究[3]，该研究共纳入546例ALS患者，其中15例出现10个SQSTM1突变，包括杂合错义突变9例(8例为致病性)、缺失突变1例，FALS和SALS的突变率分别为1.76%(6/340)和4.37%(9/206)。此后相继有6个研究在ALS患者中检出SQSTM1突变，分别来自意大利、日本、法国、爱尔兰以及美国[4, 8-12]，FALS和SALS的突变率分别为1.1%～2.38%和0～4.05%。近年来，我国陆续有4个研究报道了ALS患者的SQSTM1突变[5, 13-15]，在FALS患者中未发现SQSTM1突变，在SALS患者中突变率为0～1.38%。还有2个分别来自美国和土耳其的研究发现SALS检出SQSTM1基因突变的比例较高[16-17]。近期，Yilmaz等[18]对486例FALS患者进行SQSTM1基因突变筛查，发现了24例错义突变，突变率为4.94%。综合针对中国人种的研究，SALS患者SQSTM1基因突变率为0.93%；综合所有的研究，SQSTM1基因在FALS和SALS中的突变率分别为2.7%和1.3%。进一步把所有研究按亚洲人群和高加索人群分类，亚洲人群尚未发现FALS存在SQSTM1突变，高加索人群的FALS和SALS突变率分别为2.89%和1.50%(表2)。

表2 SQSTM1基因突变在ALS疾病中的临床研究

2.3.3 ALS疾病中SQSTM1突变位点在氨基酸中的结构分布 目前国内外报道关于ALS疾病中SQSTM1突变的共有71例，在氨基酸中主要分布于7个结构域中，即SH2(src同源结构域)、AID(酸性作用结构域)、ZZ(锌指结构域)、TRAF6(肿瘤坏死因子受体相关因子6)、2处PEST(脯氨酸/丝氨酸/苏氨酸丰富区)、UBA(泛素相关结构域)，其中在SH2/TRAF6/UBA处出现频率最高(图2)。

红色字体代表亚洲人群报道的突变位点，黑色字体代表高加索人群报道的突变位点。

2.4SQSTM1基因突变ALS患者的临床表现 71例中，56例具有详细临床表型，其中男性32例，女性24例，发病年龄(58.76±12.4)岁，生存期5～168个月(有随访到的具体数据)；有明确家族史20例，肢体起病32例，球部起病13例，不明确的11例，7例存在共患病(表3)。

表3 SQSTM1基因突变ALS患者临床表型分析

表3 (续表)

3 讨 论

本研究通过基因捕获技术筛查15例FALS和275例SALS患者SQSTM1基因的突变情况，结果显示，FALS患者中未发现SQSTM1突变，SALS患者中有1例致病突变(c.923C>T，p.P308L)，HGMD数据库中已有此位点致病性的相关报道，但在ALS中为首次报道。

SQSTM1编码泛素结合蛋白p62，通过调节自噬起作用，越来越多的研究关注SQSTM1基因突变与ALS的关系。既往的研究来自高加索人群的比较多，亚洲人群偏少，单个研究的样本量小，总体的突变特征、临床表型、不同人群的差异仍需进一步总结。本研究中，FALS患者中未检出SQSTM1突变，与既往我国、韩国、日本的研究结果一致[4-6, 15]，但似乎与高加索人群的研究结果不同。美国[3]、德国和瑞士[18]的2个样本量相对较大的研究显示，FALS出现SQSTM1突变率分别为1.76%(340例)、4.94%(486例)。然而，不管是国内还是其他亚洲人群的相关研究中，FALS的样本量均不足100例，需进一步扩大样本量才能得出可靠的结论。SALS的SQSTM1突变率在亚洲人群和高加索人群中是相当的，从总人群来看，FALS的SQSTM1突变率较SALS高。

本研究还针对SQSTM1突变在ALS中临床表型的差异进行了文献综述。本研究的1例SQSTM1突变患者于50岁起病，以下运动神经元损害为主要表现，未累及延髓，生存期32个月，是目前所有SQSTM1突变的ALS案例中第2例以进行性脊肌萎缩症(progressive muscular atrophy, PMA)为主要表现的患者。而第1例是2020年在德国FALS的研究中发现的，其起病年龄、疾病进展模式、生存期均类似，同样位于6号染色体，氨基酸位点也相近[18]。在所列的案例中，男性比例高，起病年龄33～80岁，多数以肢体起病，其中经典型ALS 22例，进行性延髓(球)麻痹(progressive bulbar palsy，PBP)11例，连枷腿综合征(flail leg syndrome，FLS)7例，连枷臂综合征(flail arm syndrome，FAS)2例，PMA 2例。SQSTM1突变的ALS患者中，共患FTD/PD/PDB 7例，主要来自高加索人群，其中3例有明确的遗传家族史，突变位点均位于第7～8号外显子，以P392L最常见。另外，研究还显示，不同氨基酸结构域的突变其临床表型和预后也不同，即使是同一位点突变，临床表型也不尽相同，如同样是A33V的错义突变，有的以球部症状起病，有的以肢体运动障碍起病，生存期从15到85个月不等，到底什么机制起作用，目前尚无相关的研究。

进一步分析关于不同突变位点的致病性、临床表型及机制的研究发现，本研究发现的突变位点P308L在ALS中属于首次报道，软件预测分析显示其突变氨基酸有害，与2002年Laurin等[22]的报道一致，按ACMG标准提示致病性。71例SQSTM1突变患者的突变形式主要有错义突变(66例)、缺失突变(2例)、内含子缺失(1例)以及剪切位点突变(2例)。不同突变形式可能表现出不同的临床表型，如2例剪切位点突变的患者，表型相对较轻，为FLS，生存期均>60个月；缺失突变或内含子缺失表现为经典的ALS，表型相对较重，生存期较短；而错义突变患者临床表型异质性大，突变率较高的是A33V(7例)、L238G(7例)、K238E(6例)和P392L(7例)。值得注意的是，亚洲人群中除了1例P392L外，尚未发现其他高频突变位点。SQSTM1基因共有8个外显子，其中8号外显子突变最常见，而4号外显子目前尚未见报道。SQSTM1编码泛素结合蛋白p62，具有7个结构功能域[4]。从突变氨基酸所在蛋白的位置来看，大部分集中在SH2、TRAF6、PEST以及UBA结构域中，上述高频突变的4个位点也分别位于这4个结构域中。目前研究比较多的是UBA结构域，在PDB疾病中，SQSTM1突变热点位于UBA，该位置直接影响泛素化蛋白结合，与自噬密切相关[23]。在ALS疾病中，P392L是常见的突变位点之一，位于UBA结构域，恰好是泛素化蛋白结合结构域。7例P392L突变患者中，男性5例，以延髓症状或肢体无力等起病，共患PD或PDB，生存期18～133个月。另外1个常见的突变位点是A33V，位于SH2蛋白结构域，也是p62重要的结合结构域。4例患者中，以延髓症状起病1例，以肢体无力起病3例，其中1例共患FTD，生存期15～94个月，大部分>24个月。另外，集中在TRAF6区域的238位氨基酸也是高频出现的位点，TRAF6的作用机制已比较明确，但这个位点突变的案例，具有明确临床表型的很少，无法进行分析。可见即使同一位点突变，临床表型也不尽相同，提示可能还有其他因素参与，如环境、人种、基因修饰等，仍需进一步研究。本研究发现的P308L错义突变，其氨基酸的位置位于PEST区域，该区域富含脯氨酸(P)、谷氨酰胺酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)，并包含许多S/TP序列，这些序列是蛋白激酶最小的一致磷酸化位点，PEST序列的多重磷酸化作用靶向蛋白，使其泛素化并通过蛋白酶途径降解[23]。理论上讲，PEST序列中断可能导致突变的SQSTM1蛋白比野生型更稳定，从而导致持续的信号传递。然而，目前还没有其他ALS引起的突变干扰SQSTM1的PEST域的具体机制报道，其作用机制仍需进一步研究。

值得一提的是，实际上SQSTM1突变最早是在PDB中发现具有致病性，包括本研究中心发现的P308L位点。此后发现SQSTM1突变可表现为其他临床表型，特别是变性疾病，如FTD/PD/ALS等。越来越多的研究表明，SQSTM1可能是ALS和(或)合并FTD/PD/PDB的共同致病基因[24-26]。有学者提出了多系统蛋白病(multisystem proteinopathy，MSP)的概念[27]，认为同时存在≥2种以下疾病：IBM/PDB/ALS/FTD为MSP。从组织病理学看，MSP受累的组织泛素化相关基因和蛋白染色阳性，包括RNA结合蛋白TDP-43、hnRNPA1和hnRNPA2B1，还有泛素化依赖的自噬相关蛋白，如p62/SQSTM1、VCP、optineurin和泛素蛋白-2[27]，以上结果进一步说明，SQSTM1突变可能是ALS共患FTD/PD/PDB的原因。但是关于SQSTM1不同突变位点如何引起不同的临床表型，包括合并何种类型共患病，其机制有待进一步探索。

总之，本研究及文献综述发现，亚洲人群SALS患者SQSTM1突变率较高加索人群低，尚未发现FALS患者SQSTM1突变的报道，还需要扩大样本量进一步研究。本研究发现的P308L突变首次在ALS患者中报道，临床表型为PMA亦为少见，已证明具有致病性，但其机制仍需进一步研究。目前关于SQSTM1突变的ALS患者以错义突变为主，其热点突变有P392L、A33V、L238G和K238E，集中于该蛋白的SH2、TRAF6、PEST和UBA结构域中，同一突变位点临床表型差异较大，SQSTM1突变可导致MSP，具体机制还需进一步探索。