基于网络药理学和分子对接研究金线莲的主要功效

林仁义， 杨丽娟， 俞晓玲， 黄丽英

网络药理学是英国药理学家Hopkins于2007年首次提出的[1]，它强调疾病的发生发展是一个长期、复杂的动态过程，复杂的生物网络失衡才是疾病的本质，即生物网络中的基因或者其产物等多个靶点处于功能失衡的状态[2]。从多成分、多靶点的研究思路出发，将药物-靶点网络与生物系统网络相结合，为新药的研发提供新的方向，且当今多靶点药物的研发也正逐渐成为一种新趋势[3-4]。单靶点药物在治疗多因素疾病如肿瘤、心血管系统、内分泌系统疾病时，往往难以达到预期效果，还可能引发毒副作用[5]。中药及其复方的活性成分复杂多样，能更好地发挥“多成分、多靶点、多通路”的协同作用，体现出整体治疗的优势。

金线莲[Anoectochilusroxburghii(Wall.) Lindl. (A.roxburghii)]是兰科开唇兰属多年生草本药用植物，素有“金草”“神草”“药之王”“鸟人参”等美誉，全草入药，具有清热凉血、解毒消肿、润肺止咳等功效，广泛用于治疗肝炎、糖尿病、肿瘤等疾病[6]。本研究通过筛选金线莲的主要活性成分和靶点，并挖掘核心靶点，旨在进一步系统地阐述金线莲的药用功效。

1 材料与方法

1.1 活性成分的收集与筛选 通过文献检索收集金线莲的活性成分，利用PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)有机小分子生物活性数据库对每个活性成分的结构进行确认，下载保存每个活性成分的三维(3D)结构，文件保存格式为“.sdf”。将文件导入Swiss ADME (http://www.swissadme.ch/) 平台，获取每个活性成分的SMILES号，点击Run查看运行结果。根据胃肠道吸收(gastrointestinal absorption，GI absorption)的高低指示口服生物利用度[7]、通过类药性指标筛选出具有良好药代动力学性质的活性成分。借助该平台，设定胃肠道吸收为“High”作为活性成分可被吸收的条件，进行口服生物利用度筛选；收集5种类药性预测结果(Lipinski，Ghose，Veber，Egan，Muegge)中≥2个为“Yes”的化合物[8-9]，筛选后的活性成分作为预测金线莲作用靶点的潜在物质基础。

1.2 靶点预测 Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)是小分子物质预测靶点的在线分析平台，其依据分子相似性原理和化学计量学方法预测化学物质的作用靶点。选择“Homo sapiens”，导入活性成分结构文件，对筛选后的活性成分进行靶点预测。选取所有预测的靶点作为金线莲活性成分的潜在作用靶点，利用Uniprot(https://www.uniprot.org/)数据库对靶点名称进行规范化。潜在作用靶点将用于构建蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络。

1.3 构建PPI网络 STRING 11.0(https://string-db.org/)是一款在线搜索已知PPI的数据库，将潜在作用靶点信息输入该数据库，选择“Homo sapiens”，构建PPI网络图，选取经过实验验证的PPI关系，线型基于“evidence”。利用Cytoscape 3.8.0软件中Network Analyzer插件分析该网络。度值较大的靶点(≥5)为Hub蛋白，即高联通的蛋白，根据中心致死率法则，高联通蛋白对于维持复杂生物网络的联通性具有更加重要的意义[10]。

1.4 分子对接验证 选择PPI网络中的Hub蛋白进行分子对接验证。采用药物分子设计模拟软件Sybyl-x2.0完成对接操作[11-12]。该软件具有分析快速、准确的优势，通过Total-Score的打分数值可直观看出活性物质和靶点的结合强度，在Compute-Minimize-Molecule模块下对每个筛选后的金线莲活性成分进行Minimize能量优化，优化次数为10 000，能量收敛标准为0.05 kcal/(mol·nm)，添加Gasteiger Hückel电荷。从RCSB PDB(http://www.rcsb.org/)蛋白质晶体结构数据库中获取靶点蛋白的3D晶体结构，并在Sybyl-x2.0软件中的Surflex-Dock模块完成AMBER7 F99力场能量优化，加氢，并基于Ligand(配体)模式产生活性口袋。活性成分和靶点蛋白采用半柔性对接，利用Total-Score打分函数评价活性成分和靶点蛋白的结合强度及活性，Total-Score值越大，说明小分子化合物与大分子蛋白质的匹配结合能力越好。以Total-Score>5为阈值[13]，舍弃<5的对接结果，筛选出金线莲活性成分的主要靶点。

1.5 靶点生物功能、通路富集分析 将金线莲活性成分的主要靶点信息输入David 6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/)，通过“Functional Annotation Tool”模块进行靶点GO富集分析和KEGG通路注释分析，选择“Homo sapiens”。金线莲的主要靶点信息直接映射到通路当中，用于分析其参与的生物学过程与调节的人体通路。

1.6 网络构建 运用Cytoscape 3.8.0软件构建金线莲“活性成分-主要靶点-通路”网络图，网络中的节点(Node)代表了“活性成分”“主要靶点”和“通路”。利用Cytoscape 3.8.0中Network Analyzer插件分析以上网络拓扑参数，包括连接度(degree)、中心介度(betweenness centrality)及紧密度(closenesss centrality)等，并根据网络拓扑学参数筛选出核心靶点及发挥药效的主要活性成分。

1.7 相关疾病的获取 CTD(http://ctdbase.org/)比较毒物基因组学数据库是一个强大的、公开的研究资源，是用于描述化学物质、基因和人类疾病之间关系的科学数据库，通过该数据库查找核心靶点的相关疾病，选择已有实验验证的“M( Marker/Mechanism)”或“T(Therapeutic)”的疾病为研究目标，统计整理可得金线莲活性成分所参与治疗的主要疾病。

2 结 果

2.1 金线莲活性成分的获取 经百度学术(https://xueshu.baidu.com)、中国知网(https://www.cnki.net)平台检索获得30篇与金线莲活性成分的相关文献，整理获得有效成分115个。因网络药理学的重点不在于讨论量效关系，对于其有效成分的含量不作具体要求，检索到的化合物一并列入。115个活性成分中，黄酮类化合物31个、挥发油类化合物44个、核苷类化合物13个、甾醇类化合物8个、三萜类化合物6个、多糖类化合物5个、生物碱类化合物2个、其他化合物6个。经过“1.1”步骤筛选后共获得45个有效成分(表1)。

表1 金线莲活性成分筛选结果

2.2 潜在靶点的获取，构建PPI网络 经筛选后的45个有效成分，通过Swiss Target Prediction平台预测潜在作用靶点，共获得靶点528个。将所有靶点的信息输入String 11.0平台中，得到蛋白质PPI网络(图1)。该网络中舍弃了没有相互作用关系以及有相互作用关系但未经实验数据验证、度值过小(<5)的靶点蛋白，剩余的靶点蛋白在维持复杂的生物网络平衡中具有更大的潜力。网络显示，共有68个节点(靶点蛋白)，307条边(相互作用关系)，度值越大，表明在该网络中与其相互作用的靶点数量越多，所处地位越核心。68个靶点将通过分子对接验证与其相应的活性成分是否具有较好的结合能力。

圆圈代表靶点()，直线代表蛋白质相互作用关系，蓝色直线(—)表示作用关系来源于专业数据库，紫色直线(—)表示作用关系来源于实验结果。

2.3 分子对接验证 利用Surflex-Dock进行分子对接具有准确性高、速度快的优点。配体和受体的结合能力、稳定性由Total-Score评价。Total-Score>5说明配体和受体具有较好的结合能力，>7说明两者具有强烈的结合活性。对68个靶点以及对应的活性成分共进行238次对接，结果显示：Total-Score>7的有43个(18.07%)、5～7的有105个(44.12%)、<5的有90个(37.81%)，总体显示有62.19%的对接结果具有较好或强烈的结合活性。保留评分结果≥5的靶点及其对应的活性成分，最终获得金线莲主要靶点56个，分子对接结果见表2。

表2 分子对接结果

2.4 靶点生物功能、通路富集分析 为探究金线莲主要靶点的生物学功能，运用DAVID数据库对56个主要靶点进行生物富集(GO)和通路注释(KEGG Pathway)分析，保留富集程度排名前20、P<0.01的条目(图2)。GO分析包括生物过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)。

A：生物过程；B：细胞组分；C：分子功能；D：通路注释。圆点代表分析富集条目，其大小代表富集的基因数目，圆点颜色的深浅代表P值的大小。

2.5 网络构建、挖掘核心靶点 运用Cytoscape 3.8.0构建金线莲“活性成分-主要靶点-通路”网络，由Network Analyzer插件分析网络拓扑参数，得到其主要活性成分和核心靶点。该网络中有103个节点(24个金线莲主要活性成分、56个主要靶点、23种信号通路)和440条边。综合参考了网络拓扑参数选出排名前10的金线莲主要活性成分的核心靶点(表3)，“活性成分-主要靶点-通路”见图3。

红色圆形节点()代表活性成分，黄色方形节点()代表靶点，绿色菱形节点()代表通路。

表3 金线莲主要活性成分的核心靶点

网络中连接度排名前10的活性成分为：α-亚麻酸、3′,4′,7-三甲氧基-3,5-二羟基黄酮、棕榈酸、鼠李秦素、2-十二烷酮、槲皮素、5,4′二羟基-6,7,3′-三甲氧基黄酮、异鼠李素、邻苯二甲酸二丁酯、芹菜素。连接度排名前10的通路为：Pathways in cancer(癌症相关通路)、PI3K-Akt signaling pathway(PI3K-Akt信号通路)、Proteoglycans in cancer(肿瘤中蛋白多糖相关通路)、Focal adhesion(黏着斑信号通路)、Ras signaling pathway(Ras信号通路)、Rap1 signaling pathway(Rap1信号通路)、Insulin resistance(胰岛素抵抗相关通路)、Hepatitis C(C型肝炎相关通路)、Thyroidhormone signaling pathway(甲状腺素信号通路)及Viral carcinogenesis(病毒致癌相关通路)。

2.6 相关疾病的获取 10个核心靶点通过CTD数据库匹配后，筛选出已有实验验证的结果，共得到154种相关疾病。将各靶点与其相关疾病构建成网络图(图4)。

黄色圆形()代表核心靶点，绿色方形节点()代表疾病。

在该网络中，一共有164个节点(10个核心靶点、154种疾病)和241条边，与核心靶点相关的疾病主要集中在肿瘤，包括乳腺、前列腺、肺、卵巢等部位的肿瘤，选取网络中连接度排名前20的疾病，即乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、肺肿瘤、肿瘤浸润、心肌病、肝外胆汁淤积、鳞状细胞癌、卵巢肿瘤、肿瘤性细胞转化、结肠肿瘤、直肠肿瘤、2型糖尿病、皮肤肿瘤、心脏肥大、严重急性呼吸系统综合症、神经元蜡样质脂褐质沉积症 、头颈部肿瘤、胃肿瘤、脑缺血、肿瘤转移。

3 讨 论

本研究利用网络药理学，通过研究活性成分作用的靶点、靶点所参与人体生物学过程及其所调节的人体通路，计算PPI网络、有效成分-靶点-通路网络、核心靶点-疾病网络中关键节点的度值，挖掘出核心的作用靶点及主治疾病，进而探讨金线莲药理作用的分子机制。

研究结果显示，控制癌症的发生和发展是金线莲最主要的功效。通路富集分析结果表明，在金线莲的56个主要靶点中，有33个(其中8个核心靶点)参与癌症相关通路的调控。富集程度最高、最显著的通路是PI3K-Akt信号通路(靶点富集数目23个，P<0.01)，核心靶点表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)位于PI3K-Akt信号通路的上游，其高表达或者突变能够为肿瘤细胞的生长和生存创造有利条件[14]，活化后的EGFR的酪氨酸激酶结构域能够激活PI3K，继而参与对 PI3K-Akt 信号通路的调控[15]，最终导致细胞逃避正常的凋亡过程。根据分子对接结果显示，金线莲中3′,4′,7-三甲氧基-3,5-二羟基黄酮、异鼠李素、芹菜素、槲皮素、5,4′二羟基-6,7,3′-三甲氧基黄酮与EGRF具有较强的结合活性。已有相关研究表明，异鼠李素能减少癌细胞蛋白磷酸化程度，有效调节EGFR的活动，抑制皮肤癌细胞的增殖[16]；槲皮素可下调EGFR的表达，抑制人乳腺癌细胞株T47D的增殖[17]；芹菜素与ABT-263(小分子Bcl-2抑制剂)联合使用能够抑制EGFR突变肿瘤细胞的生长、促进凋亡[18]。因此，推测金线莲治疗肿瘤的主要机制之一：通过异鼠李素、槲皮素、芹菜素等活性成分直接与EGFR相结合，抑制其高度表达或突变，从而引起下游信号通路的级联放大反应，进而调控肿瘤细胞的生长。

除治疗癌症外，金线莲在降低血糖、血脂以及血压方面也具有明显的功效。本研究结果显示，共13个主要靶点(其中4个核心靶点)参与对胰岛素抵抗相关通路的调控，胰岛素抵抗是2型糖尿病等多种代谢疾病的重要根源，它与高血压病、高血脂等相互影响且互为因果[19]。分子对接结果显示，糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)作为核心靶点，与鼠李秦素、山奈酚、芹菜素等活性成分具有较强的结合活性。GSK-3β的过度表达，使胰岛素受体上的丝氨酸、苏氨酸残基磷酸化，下调胰岛素受体的表达水平，削弱胰岛素信号传导通路[20]。在骨骼肌中，通过抑制GSK-3β的活性可以解除AKT2对糖原合酶活性的抑制，促进肌糖原的合成，从而降低血糖[21]。研究表明，芹菜素和山奈酚都具有改善胰岛素抵抗的功能[22-23]。因此，推测芹菜素和山奈酚可直接作用于靶点GSK-3β，继而引发胰岛素受体后的一系列变化。但二者是否通过直接作用抑制GSK-3β的活性，继而促进糖原的合成，则需要进一步的实验验证。

本研究从网络药理学的角度，进一步验证了金线莲在肿瘤、高血糖、高血脂、高血压以及心血管疾病和肝脏损伤的治疗中具有一定的功效，初步探究了金线莲的核心靶点EGFR、GSK-3β的分子作用机制。该方法对于传统中药以及外来药材的功能定位研究具有一定的借鉴作用。但本研究的结果是基于数据库的检索和计算机的模拟及筛选，对于靶点的作用机制尚需进一步实验进行验证。