中国汉族人群APOB rs10199768和rs1367117基因多态性与HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者PEG-IFN-α疗效的相关性

郭健慧， 曾勇彬， 欧启水

截至2016年，全球乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染者达2.91亿人[1]。中国慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者达2 000万，60%的肝硬化和80%的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)均由HBV感染引起[2]。干扰素α(interferon α, IFN-α)是治疗CHB的一线药物，在获得HBV表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)和e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg)清除方面优于核苷类似物[nucleos(t)ide analogues, NAs]，且复发率较低[3]。但只有少部分人能够获得持续病毒学应答，对IFN-α治疗具有个体差异的原因仍知之甚少。

载脂蛋白与肝炎病毒感染和IFN-α疗效关系密切。载脂蛋白能够中和抗体、促进丙型肝炎病毒(hepatitis C, HCV)进入肝细胞，帮助HCV逃避宿主免疫系统的识别[4]。血脂水平与IFN-α联合利巴韦林治疗HCV的疗效有关[5]。慢性HBV感染可导致血脂代谢异常，相反地，应用嗜肝脂蛋白抑制剂能够抑制肝细胞的HBV感染[6-8]。但载脂蛋白B(apolipoprotein B, APOB)与HBV感染关系的研究仍不多见，APOB与IFN-α疗效的关系尚不清楚，APOB的基因多态性在HBV治疗结局中是否扮演一定的角色还未被探索。本研究旨在探讨APOBrs10199768和rs1367117基因多态性在HBeAg阳性CHB患者IFN-α疗效中的作用。

1 对象与方法

1.1 对象 收集2017年2月-2020年12月肝病中心收治的接受聚乙二醇干扰素(pegylated interferon α, PEG-IFN-α)治疗满48周的HBeAg阳性的CHB患者124例，男性86例，女性38例，年龄(27.59±4.97)岁(20～44岁)。入选标准：(1)年龄≥16岁；(2)HBsAg阳性≥6个月，HBeAg阳性；(3)基线HBV DNA≥2 000 IU/mL；(4)血清基线丙氨酸转氨酶(alanine transaminase, ALT)≥2倍正常值上限；(5)既往未接受过任何抗病毒治疗。排除标准：(1)HCV、HIV、HDV重叠感染者；(2)接受免疫抑制剂、激素治疗、肝移植患者；(3)非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)、肝硬化、HCC等其他肝脏疾病患者。本研究经笔者医院伦理委员会批准，患者均知情同意。

124例中，PEG-IFN-α单药治疗59例，PEG-IFN-α和NAs联合治疗65例。根据PEG-IFN-α治疗结束后24周(第72周)的疗效，将患者分为两组：完全应答(complete response, CR)组38例和应答不佳(suboptimal response, SR)组86例。根据欧洲肝病学会指南(EASL 2017)定义，CR组须同时满足HBV DNA<500 IU/mL、HBeAg<1 S/CO和ALT<40 U/L；未同时满足上述标准为SR组。

1.2 方法

1.2.1 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)检测 收集EDTA抗凝全血2 mL，采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(德国QIAGEN公司)提取外周血全血DNA。采用Asian Screening Array(ASA，美国Illumina公司)芯片技术检测SNP位点，由博淼生物科技(北京)有限公司完成。SNP位点满足MAF>0.01、哈迪温伯格(Hardy-Weinberg, HWE)遗传平衡定律检验P值>0.05。

1.2.2 临床指标检测 检测PEG-IFN-α治疗的CHB患者在基线(0周)和12、24、36、48、60、72周的血清HBV DNA、HBsAg、HBeAg、ALT水平以及基线血清APOB蛋白水平。血清HBsAg和HBeAg使用化学发光微粒子免疫分析仪(Architect-i4000，美国雅培公司)检测；APOB、ALT和天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase,AST)使用全自动生化分析仪(ADVIA 2400，德国西门子公司)检测；HBV DNA使用实时荧光定量PCR仪(Roche Lightcycler480，瑞士罗氏公司)和HBV核酸定量测定试剂盒(PCR-荧光探针法，中国湖南圣湘生物科技有限公司)测定。

1.2.3 外周血单个核细胞(peripheral blood monocular cell, PBMC)培养 随机纳入未经任何抗病毒治疗的HBV感染者99例，其中rs10199768 CC型92例、AC型6例、AA型1例；rs1367117 GG型75例、AG型22例、AA型2例。取1 mL EDTA抗凝全血经Ficoll分离液分离出PBMC后，用96孔板在37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养18 h。加入IFN-α(1 000 U/mL)作用6 h，收集细胞进行RNA的提取和检测。

1.2.4 引物设计 mRNA引物在GenBank上进行设计，并经BLAST序列比对验证其准确性及特异性。SNP位点所在序列的引物通过GenBank上选取位点前后各5 000 bp(共10 000 bp)的FASTA序列，复制到Oligo 7软件上进行设计，选取位点处于扩增产物(350～550 bp)内并距两端20 bp以上的引物序列。引物由上海华大基因有限公司合成(表1)。

1.2.5 实时荧光定量PCR 使用TRIZol试剂(Thermo Fisher，美国Invitrogen公司)于-20 ℃保存RNA，RNA提取和逆转录采用北京全式金生物技术有限公司的试剂盒。实时荧光定量PCR使用TB Green Premix Ex Taq(日本TaKaRa Bio株式会社)，qRT-PCR反应条件：预变性95 ℃ 30 s；解链95 ℃ 5 s→退火60 ℃ 30 s→延伸72 ℃ 30 s，40个循环；延伸72 ℃ 5 min。

2 结 果

2.1 一般资料 患者的性别、年龄、基线HBsAg、HBeAg、HBV DNA、ALT、AST水平在CR组和SR组间的分布差别均无统计学意义(P>0.05)；PEG-IFN-α单药治疗和PEG-IFN-α联合NAs治疗在CR组和SR组间的分布差别也无统计学意义(P>0.05，表2)。

2.2APOB基因多态性与CHB患者PEG-IFN-α的疗效相关APOBrs10199768和rs1367117的基因型在CR组和SR组间的分布差别有统计学意义(P=0.036和P=0.021)。两个位点的多态性经Pearsonχ2检验，均符合HWE遗传平衡定律：rs10199768 C>A，CR组P=0.597，SR组P=0.825；rs1367117 G>A，CR组P=0.130，SR组P=0.947。SR组中的rs10199768 CC基因型和C等位基因频率显著高于CR组(P=0.036和P=0.040)，rs1367117 GG基因型和G等位基因频率显著高于CR组(P=0.021和P=0.017，表3)。

2.3 APOB在SR组中的表达较CR组高 SR组的基线血清APOB水平较CR组高(P=0.007)，但APOB水平在rs10199768 GG/AG基因型和rs1367117 CC/AC基因型中的分布差别则无统计学意义(P>0.05，图1)。

2.4 rs10199768、rs1367117与PEG-IFN-α治疗过程临床指标的关系 PEG-IFN-α治疗0、12、24、36、48、60、72周，HBV DNA、HBsAg、HBeAg和ALT水平在APOBrs1367117 GG型和AG型中的差别均无统计学意义(P>0.05)。PEG-IFN-α治疗12和24周时，APOBrs10199768 AC型患者的HBeAg浓度较CC型低(P=0.017和P=0.018)(图2)。

2.5 rs10199768影响IFN-α体外诱导的抗病毒蛋白的表达 IFN-α体外刺激PBMC后，ADAR、MxA、OAS1、PKR、ISG20、ISG15、JAK1、STAT1、STAT2、USP18、SOCS1、SOCS3、PIAS1、PTPN6、IFIT3和STING的mRNA水平在rs1367117不同基因型间的表达差别无统计学意义(P>0.05)；rs10199768 AA+AC型感染者的STAT1和ISG15的mRNA表达水平较CC型高(P=0.005和P=0.018)，其他基因的表达差别无统计学意义(P>0.05，图3)。

3 讨 论

HBV感染可引起慢性肝炎、肝硬化和HCC，积极治疗CHB仍是临床关注的重点。IFN-α治疗CHB的HBeAg血清学转换率为30.75%～36.3%，其疗效存在个体化差异[3]。研究表明，宿主基因的SNP可能是IFN-α治疗个体化差异的因素之一[9-11]。

APOB是低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)、极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL)等的主要成分，主要参与甘油三酯(triglyceride, TG)和胆固醇酯(cholesteryl ester, CHE)的转运[12]。血清APOB水平与肝脏疾病进展有关。APOB与HCV感染关系密切。APOB为HCV进入肝细胞并产生具有完全传染性的HCV所必需，抑制APOB的表达可减少HCV感染[13]。APOBN4311S (g.41553a > g) rs1042034的AA基因型与HCV阳性显著相关，可能通过促进HCV经LDL受体进入肝细胞而影响HCV感染[14]。APOB-516C/T启动子的基因多态性可能是女性HCV感染的保护因素[15]。在HBV感染时，HBV可通过抑制微粒体TG转移蛋白阻断APOB的表达，HBx蛋白还能抑制APOB的分泌和加速胆汁酸的合成[16-18]。但APOB与HBV感染结局关系的相关研究仍然较少，研究显示，血清APOB水平与PEG-IFN-α治疗CHB的疗效相关[19]。本研究也发现，APOB水平与PEG-IFN-α治疗CHB应答不佳有关，但具体机制有待进一步探索。

rs10199768位于APOB基因的内含子，内含子在基因编辑和遗传调控中的作用仍有待研究。rs1367117位于APOB基因的第4外显子，A等位基因的出现使编码的氨基酸发生错义突变，由苏氨酸变成异亮氨酸。研究显示，rs1367117对脂质性状具有极显著的加性遗传效应，对肥胖性状具有极显著的母系特异性效应[20]。本研究发现，rs10199768和rs1367117与CHB患者PEG-IFN-α的疗效相关，rs10199768 A等位基因与PEG-IFN-α治疗CHB患者的应答有关，rs1367117 G等位基因与PEG-IFN-α治疗CHB患者的应答不佳有关。rs10199768 A等位基因与PEG-IFN-α治疗早期HBeAg水平的下降有关；在探索rs10199768 A等位基因如何参与IFN-α抗病毒作用的机制中发现，IFN-α体外刺激含有A等位基因的HBV感染者的PBMC后，STAT1和ISG15基因的mRNA表达增高，提示A等位基因可能有助于IFN-α诱导的抗病毒蛋白的表达，从而提升IFN-α的效应。但本研究并未发现rs1367117 A等位基因参与了IFN-α的效应作用。

不同于其他PEG-IFN-α单药治疗的研究，本研究同时纳入了PEG-IFN-α与NAs联合治疗的样本。PEG-IFN-α被认为能够提高患者的免疫应答能力而发挥抗病毒作用，而NAs作为逆转录酶抑制剂，能够抑制HBV DNA的复制，二者的抗病毒机制并不相同。NAs持续抑制HBV DNA，PEG-IFN-α的HBeAg清除率高[21]，因此临床上二者联合或序贯用药非常普遍。但NAs联合用药并不影响在PEG-IFN-α疗程终点的疗效判断，本研究中两种用药方式在不同应答组中的分布差别并无统计学意义。本研究纳入的样本能够反映治疗人群的整体构成，具有代表性。

APOB基因多态性与CHB患者IFN-α疗效关系的研究仍较罕见，本研究为遗传因素在IFN-α抗病毒治疗中的作用提供了依据，APOB基因多态性检测可能有助于在抗病毒治疗前预测对IFN-α应答较好的患者，对CHB患者的精准治疗起关键作用。APOB基因多态性如何参与IFN-α抗病毒作用，将来是否成为IFN-α治疗前的生物标志物，仍需通过更大的样本量和更深入的机制进行研究。