鞘内注射LY294002对保留性脊神经损伤大鼠脊髓中PI3K和pERK信号的影响

刘荣国， 米立梅， 徐雪汝， 方向宇， 林星武



鞘内注射LY294002对保留性脊神经损伤大鼠脊髓中PI3K和pERK信号的影响

刘荣国， 米立梅， 徐雪汝， 方向宇， 林星武

目的观察保留性脊神经损伤(SNI)大鼠鞘内注射LY294002能否通过抑制脊髓中磷脂酰肌醇-3-激酶PI3K，进而影响pERK信号而缓解神经病理性疼痛。方法24只雄性SD大鼠随机分为4组，即假手术(Sham)组、SNI组、SNI+二甲基亚砜(DMSO)组及SNI+LY294002(PI3K抑制剂)组，每组6只，其中SNI+LY294002组和SNI+DMSO组分别于SNI后第5天经鞘内注射LY294002和等体积DMSO，每天1次，直到SNI后第14天。SNI前和SNI后1，3，5，7，10，14 d，测定大鼠机械刺激缩足反应阈值(PWMT)和热辐射刺激缩足反应潜伏期(PWTL)。SNI后第14天，大鼠麻醉后取腰段脊髓行Western-blot检测PI3K和pERK的表达。结果与Sham组比较，SNI后各时点SNI组大鼠的PWMT和PWTL均下降，脊髓中PI3K和pERK表达则显著增强(P<0.05)。与SNI组和SNI+DMSO组比较，SNI后各时点SNI+LY294002组大鼠的PWMT和PWTL均显著增高(P<0.05)，PI3K和pERK的表达则下降(P<0.05)。结论经鞘内注射LY294002可抑制脊髓中PI3K，进而影响pERK信号而缓解SNI大鼠神经病理性疼痛。

神经病理性疼痛； 1-磷脂酰肌醇3-激酶； 细胞外信号调节MAP激酶类

国际疼痛研究学会把由于躯体感觉系统损伤或疾病所引起的疼痛定义为神经病理性疼痛[1]。一系列外周神经的损伤，包括糖尿病、艾滋病、带状疱疹等均可导致神经病理性疼痛的发生[2]。然而其发生机制尚未完全阐明，可能与初级感觉神经元兴奋性异常增强有关，但其临床疗效欠佳。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)是一种与细胞内信号传导有关的脂类第二信使，并参与病理性疼痛过程，有可能是病理性疼痛的治疗靶点之一[3]。研究发现，采用脊神经结扎(spinal nerve liagation, SNL)模型，于SNL术前经鞘内给予LY294002(PI3K抑制剂)可以减缓疼痛形成[4]。但临床上神经病理性疼痛的发生具有不可预测性，提前给予治疗用药不符合伦理和临床实际。当神经病理性疼痛发生后，才能切合实际地使患者接受相关的药物和技术治疗。SNL和保留性脊神经损伤模型(spared nerve injury, SNI)同属常见的神经病理性疼痛模型，SNI后经鞘内注射LY294002能否同样缓解神经病理性疼痛的敏化形成，有待研究。已知神经损伤后可促发小胶质细胞中pERK的活化，而PI3K产生的第二信使可激活pERK[5-6]。本研究拟探讨鞘内注射LY294002能否通过抑制SNI大鼠脊髓中的PI3K和pERK信号通路发挥镇痛作用，为未来临床应用PI3K抑制剂治疗神经病理性疼痛提供实验支持依据。

1　材料与方法

1.1动物及分组24只成年雄性健康SD大鼠，SPF级[福建省医学科学研究院，许可证号：SYXK(闽)2011-0002]，体质量250～280 g，采用随机数字表法分为4组(n=6)：假手术组(Sham)、SNI组、SNI+二甲基亚砜(DMSO)组及SNI+LY294002组。饲养环境为：室温22～24 ℃，相对湿度50%左右，模拟昼夜照明周期为12 h∶12 h，自由摄水摄食。

1.2方法

1.2.1各组大鼠处置方法Sham组仅暴露坐骨神经及其分支但不结扎；SNI组：暴露坐骨神经并结扎；SNI+DMSO组、SNI+LY294002组制备SNI模型并于SNI模型后第5天分别鞘内注射DMSO和LY294002。

1.2.2鞘内置管方法和给药方法10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，俯卧位，消毒铺巾，以大鼠脊柱正中髂嵴连线水平为中心做纵向切口，分离并暴露L3-4间隙，于L3-4两关节突结合处内侧，用22G针头刺穿黄韧带，至大鼠甩尾后停止，拔出针头，用镊子轻轻地将PE-10导管向上置入，置入深度为1.5～2 cm，待大鼠出现甩尾反应，导管内有清亮的脑脊液流出，提示鞘内置管成功。4-0丝线固定导管于肌肉处，并经皮下隧道将导管引出至颈部皮肤，再次缝合固定。用0.1 mL生理盐水冲洗导管，堵塞导管外口以避免脑脊液外溢。鞘内注射2%利多卡因20 μL后即刻出现双下肢麻痹的大鼠提示置管成功，纳入实验组。SNI模型后第5～14天，SNI+LY294002组每天鞘内注射溶于10 μL DMSO的2.5 μg的LY294002，SNI+DMSO组鞘内注射10 μL的DMSO，之后用10 μL的生理盐水冲洗管道。

1.2.3SNI模型成功鞘内置管后，参照Decosterd等的方法[7]，SD大鼠经腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg麻醉，俯卧位，在无菌环境下暴露坐骨神经及其分支(腓肠神经、腓总神经和胫神经)。4-0丝线结扎，切断腓总神经和胫神经，保留腓肠神经。为保证实验的一致性，手术操作均由同一人完成。大鼠SNI模型成功的标志为术侧后爪不堪重负、足趾并拢外翻和自发性的缩足反应等。

1.2.4运动功能观察所有SD大鼠在术前和术后均测体质量，作为健康状况的评价指标。观察动物自然状态下随意行走的步态，采用记分制：1分为正常步态、足无畸形；2分为正常步态伴明显足畸形；3分为轻度步态障碍伴足下垂；4分为严重步态障碍伴肌无力。评分4分的大鼠剔除。

1.2.5疼痛行为学观察和测量于术前和术后1，3，5，7，10，14 d实施行为学观察，所有观察均由同一人在固定时间(上午8:00～12:00)于安静环境中进行。

1.2.5.1机械刺激缩足反应阈值(paw withdrawal mechanical thresholds，PWMT)按照Chaplan的方法[8]，用Von Frey纤维(Stoeling, Wood Dale，1L, USA)以up-and-down法测定PWMT，将透明玻璃箱置于金属筛网上，大鼠适应15 min后，以Von Frey针丝垂直刺激大鼠术侧后足掌部，弯曲至90°，持续6～8 s，每侧足底测定5次，大鼠出现缩足或者舔足反应则为阳性反应。刺激力度从2 g开始，当刺激力度不足以引起阳性反应，则给予相邻大一级的力度刺激，如此连续进行，直至出现第1次阳性反应，再连续测定4次，取平均值为阈值，最大力度为15 g，大于此值时记为15 g。每次刺激间隔30 s，每次测量时使尼龙丝弯曲到相同的弧度，以确保每次施加的刺激相同[9]。

1.2.5.2热辐射刺激缩爪反应潜伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL)按照Hargreaves的方法[10]，使用热辐射测痛仪(BME410，天津中国医学科学院生物医学工程研究所)测定大鼠的热痛阈。调整测痛仪的热刺激强度，使正常热痛阈为8～10 s。大鼠被置于单独的透明有机玻璃容器中，预适应15 min，采用测痛仪对大鼠右侧足底中部进行照射，记录热刺激缩足反射时间，读数精确至0.01 s。每只大鼠每回测量5次，每回间隔6 min，取平均值为热痛阈值。单次照射不超过30 s，以免损伤照射部位[11]。

1.2.6Western-blot法检测PI3K、pERK的表达大鼠腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg麻醉后，迅速取L4-5脊髓节段置于液氮中保存待测。检测时取EP管，分别称质量标记，把组织剪切成小块装EP管中，称质量。按每20 mg组织加200～400 μL的比例加入裂解液，取出脊髓组织放入匀浆器，冰上机械匀浆裂解30 min后，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，小心吸取上清，采用BCA法测定蛋白样品浓度，蛋白样品煮沸5 min变性，等量蛋白样品经10% SDS-PAGE凝胶电泳分离后，以湿转法电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃轻摇过夜，加入辣根氧化物酶标记物的羊抗兔IgG(1∶5 000，美国Thermo公司)，室温孵育1 h，加ECL(美国Thermo公司)化学发光液，凝胶成像分析仪(美国Bio-Rad公司)成像，以目的蛋白条带光密度值与制模前条带光密度值的比值反映蛋白表达水平。

2　结　果

2.1一般行为学观察SNI模型建立后的第2天，大鼠即出现不同程度的神经损伤，表现为同侧足趾并拢外翻、跛行、下肢软弱无力、舔舐等行为学改变，神经损伤侧后足触碰地面后即刻抬起，无任何刺激的条件下，SNI大鼠均自发缩足。Sham组的大鼠行动自如，情况良好。SNI+LY294002组大鼠在给予LY294002后，上述症状减轻。造模前各组大鼠体质量均为250～280 g，造模后各组大鼠体质量按正常增加。

2.2PWMT的变化4组大鼠术前PWMT比较，无显著性差异(P>0.05)。SNI后1，3，5，7，10，14 d，Sham组的PWMT高于其他3组，差别有统计学意义(P<0.05)。SNI+LY294002组的PWMT均高于SNI组和SNI+DMSO组(P<0.05)，提示LY294002提高了大鼠的机械痛阈。SNI组和SNI+DMSO组间差别则无统计学意义(P>0.05，表1)。

表1　鞘内注射LY294002对SNI大鼠右足机械痛阈的影响

n=6.Sham：假手术；SNI：保留性脊神经损伤模型； SNI+LY294002：保留性脊神经损伤模型+PI3K抑制剂； SNI+DMSO：保留性脊神经损伤模型+二甲基亚砜.与Sham组比较，☆：P<0.05； 与SNI+LY294002组比较，#：P<0.05.

2.3PWTL的变化 4组大鼠术前PWTL无差异(P>0.05)，SNI术后1，3，5，7，10，14 d，Sham组的PWTL均高于其他3组，差别有统计学意义(P<0.05)。SNI+LY294002组的PWTL均高于SNI组和SNI+DMSO组(P<0.05)，提示LY294002增强了大鼠的热痛阈。SNI组和SNI+DMSO组间差别则无统计学意义(P>0.05，表2)。

2.4PI3K和pERK表达SNI+LY294002组中，术后第14天大鼠脊髓中PI3K和pERK含量较SNI组和SNI+DMSO组有所减少，差别有统计学意义(P<0.05)，提示LY294002减少了PI3K和pERK的表达。SNI组大鼠脊髓中PI3K和pERK含量高于Sham组(P<0.05)；SNI组和SNI+DMSO组差别无统计学意义(P>0.05，图1)。

表2　鞘内注射LY294002对SNI大鼠右足热痛阈的影响

n=6.Sham：假手术； SNI：保留性脊神经损伤模型； SNI+LY294002：保留性脊神经损伤模型+PI3K抑制剂； SNI+DMSO：保留性脊神经损伤模型+二甲基亚砜.与Sham组比较，☆：P<0.05；与SNI+LY294002组比较，#：P<0.05.

3　讨　论

神经病理性疼痛为疑难痛症，临床表现为针刺样、烧灼样、电击样痛，并伴有感觉超敏、感觉过敏或感觉异常。与伤害感受性疼痛相比，该类疼痛在发生机制上更加复杂，不仅包含了中枢神经和外周神经敏化引发的疼痛信号放大，更可能与初级感觉神经元兴奋性异常增强有关。既往研究发现，大鼠足趾切口痛会促使小胶质细胞中的PI3K激活，抑制PI3K会缓解切口部位的急性疼痛[12]。骨癌患者小胶质细胞中PI3K增加，抑制其活性亦可减轻癌性疼痛[13]。上述研究提示，PI3K参与了急性疼痛与癌性疼痛的信号传导。选择经鞘内注射给药方式位点准确。因此，本研究选择经鞘内注射PI3K抑制剂LY294002，进一步探索抑制脊髓中的PI3K-pERK通路能否缓解神经病理性疼痛。

本研究观察大鼠SNI模型后和给予鞘内注射LY294002后疼痛的变化，结果显示，SNI后，大鼠痛阈明显下降，鞘内注射LY294002后痛阈则增加；同时，SNI组大鼠脊髓中的PI3K表达量强于SNI+LY294002组。再次表明，PI3K在神经病理性疼痛中发挥了重要作用，经鞘内注射LY294002也可缓解早期形成的神经病理性疼痛。

ERK是丝裂原激活蛋白激酶家族中的一种，pERK能够传递大量的细胞外信息到细胞内。有研究发现，小胶质细胞中的ERK信号通路介导了各种各样的疼痛，抑制ERK的活性能减缓相应的疼痛[14-15]。本试验观察SNI后14 d大鼠脊髓中的pERK变化，结果发现，SNI组pERK含量显著高于对照组，与之前的研究结果一致[16]。再次提示，pERK信号通路在神经病理性疼痛中发挥了重要作用。值得注意的是，在炎性疼痛和骨癌痛中，pERK的活性可被PI3K抑制剂所抑制[17-18]。为了确认上述发现是否在神经病理性疼痛中同样存在，在SNI后第5～14天，每日实施鞘内注射LY294002，同时观察大鼠脊髓中pERK含量的变化。结果发现，经鞘内注射PI3K抑制剂后，大鼠脊髓中pERK含量下降，同时痛阈上升。这一结果提示，PI3K抑制剂可以影响ERK磷酸化的表达。

综上所述，在SNI模型中，PI3K和pERK含量同时增加，给予PI3K抑制剂后，在减缓疼痛的同时pERK表达下降。

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(编辑：何佳凤)

Intrathecal LY294002 Injection Inhibits Spinal PI3K and pERK Induced by SNI in Rats

LIU Rongguo, MI Limei, XU Xueru, FANG Xiangyu, LIN Xingwu

Department of Pain Management, Fujian Provincial Hospital, Provincial Clinical College,Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China

ObjectiveTo observe whether intrathecal LY294002 injection could inhibit PI3K-pERK to alleviate neuropathic pain induced by SNI in rats.Methods24 adult male rats of Sprague Dawley (SD) were randomly divided into four groups: Sham, SNI (spared nerve injury), SNI+DMSO and SNI+LY294002 (n=6).Rats in SNI+ LY294002 group and SNI+DMSO group received intrathecal LY294002(PI3K inhibitor) and DMSO daily from day 5 to day 14 after SNI, respectively.Paw withdrawal mechanical thresholds (PWMT) and paw withdrawal thermal latency (PWTL) were measured on the 1st day before SNI and 1, 3, 5, 7, 10 and 14 days after SNI.On day 14 after SNI, all rats were killed under deep anesthesia, and their lumbar spinal cords were dissected to detect the levels of PI3K and pERK with western blot analysis (n=6).ResultsCompared with those in Sham group, the PWMT and PWTL in SNI group were all decreased, whereas the PI3K and pERK levels were increased on day 14 after SNI(P<0.05).Compared with those in SNI and SNI+DMSO group after SNI, the PWMT and PWTL in SNI+LY294002 group were all up-regulated (P<0.05), however, the PI3K and pERK levels were down-regulated on day 14 after SNI (P<0.05), which indicated that LY294002 relieved mechanical allodynia and thermal hyperalgesia induced by SNI.ConclusionsThe results from this study show that intrathecal LY294002(PI3K inhibitors) inhibits PI3K and pERK, therefore it can alleviate neuropathic pain induced by SNI in rats.

neuropathic pain; 1-phosphatidylinositol 3-kinase; extracellular signal-regulated MAP kinases

2016-02-29

福建省科技计划重点资助项目(2014Y0010);福建省卫生系统第四批学术技术带头人培养基金

福建医科大学 省立临床医学院，福建省立医院 疼痛科，福州350001

刘荣国(1970-)，男，主任医师，医学博士. Email: lrgfw88@sina.com

R319； R-332； R345.57； R741.02； R977.3

A

1672-4194(2016)05-0290-05