TSP-1和MMP-9在乳腺癌组织中的表达意义

傅芳萌， 黄建平， 黄　萌， 王　川



TSP-1和MMP-9在乳腺癌组织中的表达意义

傅芳萌， 黄建平， 黄萌， 王川

目的探讨乳腺癌组织中凝血酶敏感蛋白1(TSP-1)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达及其与肿瘤微血管生成、患者预后的关系。方法采用免疫组织化学方法检测131例乳腺癌患者组织中TSP-1、MMP-9的表达情况，比较研究指标的表达情况和肿瘤组织中微血管密度(MVD)及其与患者临床病理特征、预后的关系。结果131例中，肿瘤间质中TSP-1的表达和肿瘤的MVD呈负相关(Spearman相关系数=-0.241,P=0.006)；肿瘤细胞中MMP-9与肿瘤间质中TSP-1共同高表达与乳腺癌组织大小、淋巴结转移、病理分期密切相关(P<0.05)；生存分析发现二者共同高表达的患者相对于二者非共同高表达的患者预后不佳。结论乳腺癌组织中MMP-9联合TSP-1共同高表达可作为评价乳腺癌预后有价值的标记物。

乳腺肿瘤； 凝血酶敏感蛋白1； 基质金属蛋白酶9； 基质金属蛋白酶类； 毛细血管； 预后

肿瘤微环境(tumor microenviroment)是由肿瘤细胞和肿瘤间质共同组成，二者相互作用，贯穿肿瘤发生发展的整个过程，并影响肿瘤细胞的生长、血管形成、转移等多个病理生理过程。本研究中的2个分子分别为来源于肿瘤间质的凝血酶敏感蛋白1(thrombospondin 1, TSP-1)和来源于肿瘤细胞的基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9,MMP-9)，其各自在乳腺癌中的表达以及对乳腺癌各种生物学行为的影响已有报道，但把这2个分子置于乳腺癌微环境中，对2种分子之间的相互作用、对肿瘤血管生成的影响，以及二者的表达状态对乳腺癌生物学行为和预后影响的研究尚未见报道。笔者采用免疫组织化学检测方法，评估131例乳腺癌患者的组织切片，以期判断2种分子在乳腺癌中的表达情况，并探讨其表达情况对乳腺癌患者预后的影响。

1　对象与方法

1.1对象收集2002年2月-2004年12月于笔者医院行手术治疗的女性乳腺癌患者131例，发病年龄(51.42±11.76)岁(24～92岁)，其中浸润性导管癌99例，浸润性小叶癌及其他类型的乳腺癌32例，具体临床病理特征见表1。患者均经病理检查证实为浸润性乳腺癌，且术前均未进行任何的新辅助化疗及内分泌治疗等其他抗肿瘤治疗，均行包含手术的综合治疗。

表1131例浸润性乳腺癌患者的临床病理参数概况

Tab 1The clinicopathological character of 131 breast cancer patients

临床病理参数n(%)月经史　绝经前67(51．1)　绝经后64(48．9)病理类型　浸润性导管癌99(75．6)　浸润性小叶癌及其他类型32(24．4)肿瘤大小　T1+T2114(87．0)　T3+T417(23．0)淋巴结转移　阴性72(55．0)　阳性59(45．0)病理分期　Ⅰ期31(23．7)　Ⅱ期67(51．1)　Ⅲ期33(25．2)组织学分级　Ⅰ级22(16．8)　Ⅱ级67(51．1)　Ⅲ级42(32．1)ER表达状态　阴性50(38．2)　阳性81(61．8)PR表达状态　阴性58(44．3)　阳性73(55．7)HER⁃2表达状态　阴性103(78．6)　阳性28(21．4)

ER：雌激素受体；PR：孕激素受体；HER-2：人表皮生长因子受体2.

1.2方法

1.2.1调阅档案资料所有病例均重新在病案室和病理科调阅档案资料，核对患者病案号、姓名、年龄、术前临床检查资料、术后病理资料、治疗情况和预后信息，对部分术后病理信息不明确的患者均复审病理切片或取原有蜡块重新切片检测评估。

1.2.2免疫组织化学检测组织标本经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，常规H-E染色。常规连续石蜡切片，厚约4 μm，本实验中仅CD34抗原进行高温高压柠檬酸热修复，TSP-1和MMP-9抗原不需进行抗原修复。抗体分别是羊抗人TSP-1多克隆一抗(N-20，美国Santa Cruz Biotecnology公司)，进行1∶400稀释；鼠抗人MMP-9单克隆一抗工作液(56-2A4)，鼠抗人CD34单克隆一抗工作液(VG1)，均购自福州迈新生物技术有限公司，为即用型抗体。TSP-1抗原采用免疫组织化学SP法进行染色，MMP-9、CD34抗原采用MaxvisionTM法进行染色。以PBS代替一抗作为阴性对照，已知骨髓巨核细胞TSP-1阳性标本作为TSP-1阳性对照，以已知乳腺癌MMP-9阳性标本作为MMP-9阳性对照。

1.2.3结果判定(1)TSP-1蛋白主要定位于间质细胞胞质，400倍光学显微镜下随机选取10个热点区域视野计算阳性细胞百分率并计分，参照文献[1]将TSP-1蛋白表达分为2组，其中低表达组为TSP-1蛋白呈局灶阳性且<30%肿瘤间质着色；高表达组为超过30%肿瘤间质着色，即强阳性。(2)MMP-9蛋白主要定位于肿瘤细胞胞质，部分间质细胞亦可着色，采用半定量积分法判断结果。400倍光学显微镜下随机选取10个有代表性的视野计算阳性细胞百分率并计分，阳性细胞<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。按细胞显色强度计分：无显色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两项积分相乘，≥8分为高表达组，<8分为低表达。以CD34标记血管内皮细胞，平均微血管密度(microvescular density，MVD)根据文献报道的方法进行计算[2]，所有患者平均MVD为(12.7±4.59)，以12.7为标志，将平均MVD分为高MVD组和低MVD组。

1.2.4随访通过电话及门诊复查的方式对131例乳腺癌患者进行随访，随访截止时间为2010年12月31日。

1.3统计学处理将患者信息及实验检测结果用EXCEL软件建立数据库，运用SPSS 16.0软件进行统计分析。TSP-1和MMP-9表达情况与乳腺癌临床病理参数的相关性采用χ2检验或Fisher确切概率法；两个独立变量间的相关性评估采用Spearman相关系数检验；生存分析采用Kaplan-Meier曲线法，Log-rank检验单因素和多因素Cox回归比例风险模型。所有统计检验均为双侧概率检验，以α=0.05为检验水准。

2　结　果

2.1免疫组织化学染色结果MMP-9蛋白阳性信号主要定位于乳腺癌癌细胞胞质中，肿瘤间质细胞亦有轻度表达，呈黄色或棕黄色。乳腺癌癌细胞多呈强阳性表达，常为片状、灶状散在分布，其MMP-9高表达约64.9%(85/131)，周围正常乳腺组织小叶及导管上皮细胞中呈无表达或弱表达。TSP-1蛋白阳性信号主要定位于肿瘤间质中，特别是同癌巢邻近的间质，主要表达于成纤维细胞、肌成纤维细胞、血管平滑肌细胞，血管周围基底膜等，常呈片状分布。TSP-1高表达率约52.3%(69/131)，部分乳腺癌细胞胞质呈轻度非特异性染色。2种蛋白共同高表达的患者50例(38.2%)。同一张乳腺癌切片的近同一个区域TSP-1、MMP-9及微血管的表达情况见图1。

2.2各个指标与乳腺癌MVD及临床病理特征的关系从表2可看出，肿瘤间质TSP-1的高表达同肿瘤MVD呈弱的负相关(Spearman相关系数为-0.241,P=0.006)，而肿瘤细胞MMP-9高表达、TSP-1和MMP-9的共表达与MVD无关(结果另文发表)。如表3所示，131例中，将MMP-9和TSP-1同时呈高表达的病例归为共同高表达组，与其他病例组成的非共同高表达组进行比较，发现共同高表达组和更高的肿瘤大小分期(T3+T4)、腋窝淋巴结转移以及更高的病理分期密切相关(χ2分别为8.700，5.488，8.615，而相应的P值达到0.003，0.019，0.013)，差别均具有统计学意义，而与肿瘤病理类型、组织学分级及雌激素受体(estrogen receptor, ER)、孕激素受体(progesterone receptor, PR)、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2, HER-2)的表达状态无关(P>0.05)，提示MMP-9和TSP-1共同高表达组的乳腺癌患者较其他病例组的患者具有更多不良的预后因素，可能与肿瘤的恶性生物学行为存在关系。

表2　乳腺癌组织TSP-1表达及其与MVD的相关性

TSP-1：凝血酶敏感蛋白1；MVD：微血管密度.

表3MMP-9和TSP-1共同表达同乳腺癌临床病理参数的关系

Tab 3The relationship of Co-expression of MMP-9 and TSP-1 with clinicopathologic character of breast cancer

临床病理参数n总MMP⁃9和TSP⁃1表达情况n非共同高表达n共同高表达月经状态　绝经前644222　绝经后673928病理类型　浸润性导管癌996237　其他类型321913肿瘤大小☆☆　T1+T21147638　T3+T417512淋巴结转移☆　阴性725121　阳性593029病理分期☆　Ⅰ期31247　Ⅱ期674324　Ⅲ期331419组织分级　Ⅰ级+Ⅱ级895732　Ⅲ级422418ER状态　阴性502921　阳性815229PR状态　阴性583424　阳性性734726HER⁃2状态　阴性1036637　阳性281513

TSP-1：凝血酶敏感蛋白1； MMP-9：基质金属蛋白酶9； ER：雌激素受体； PR：孕激素受体； HER-2：人表皮生长因子受体2.☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.

2.3MMP-9和TSP-1共同表达情况与乳腺癌预后的相关性如图2所示，先采用Kaplan-meier曲线法和Log-rank检验对乳腺癌MMP-9、TSP-1二者共同高表达与乳腺癌无病生存率(disease-free survival, DFS)和总生存率(overall survival, OS)的关系进行分析，发现MMP-9、TSP-1共同高表达可以显著降低DFS和OS,其5年DFS和OS分别为68.0%和74.0%，而MMP-9、TSP-1二者非共同高表达的患者，5年DFS和OS分别为87.2%与90.8%，差别均有统计学意义，提示这2个指标共同高表达可能预示患者预后不良。进入多因素Cox回归风险比例模型进行分析后(表4，5)，除了肿瘤大小、组织学分级为影响患者DFS和OS的独立预后因素之外，MMP-9、TSP-1共同过表达也成为影响DFS的独立预后因子(P=0.028，危险比为2.288，95%CI为1.094～4.786)，但是对OS的影响接近有意义的统计学差异(危险比为2.169，95%CI为0.963～4.887)。

3　讨　论

TSP-1是一种高分子量的糖蛋白，主要来源于肿瘤间质，是一种内源性血管生成抑制因子，在肿瘤微环境中广泛与其他蛋白相互作用，从而影响活化的转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的水平。TSP-1还可以调节肿瘤间质的构成以及间质中MMP的活性[3]，这其中也包括了MMP-9，而且TSP-1表达还可以影响到肿瘤组织中MMP-9的表达量[4]，从而进一步影响肿瘤的侵袭转移。此外疾病病程中，TSP-1和MMP-9亦可以参与病变组织中微血管生成，从而影响疾病的发展[5-6]。

笔者的研究发现，乳腺癌组织间质中TSP-1蛋白的表达同肿瘤间质中的MVD存在弱的负相关(Spearman相关系数为-0.241，P=0.006)，与Fontana等观察到的结果一致[7]。而Rice等并未在乳腺导管原位癌病例中发现间质TSP-1的表达与MVD的高低存在着相关[8]，这与浸润性乳腺癌和导管原位癌有着不同的肿瘤微环境相关，肿瘤发展的不同时期,血管的生成受微环境中多种促血管生成因子(如VEGF等)和抑制血管生成因子共同作用，因而笔者观察到浸润性乳腺癌间质TSP-1蛋白的表达确实同MVD存在着负相关，但是相关性很弱，与其他调节血管生长因子的作用影响相关。Naumov等发现，在肿瘤的早期阶段，仅有一小部分肿瘤细胞具有促血管生成能力和发生转移，此时间质成纤维细胞中增加TSP-1的表达，并发挥抑制血管生成和肿瘤生长的作用；以后随着肿瘤的进展，延长TSP-1的作用时间，肿瘤细胞会发生转变，增加VEGF和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)等促血管生成因子的表达，并激活PI3K/MYC信号传导途径，此时高水平的VEGF可慢慢抑制TSP-1的作用，并促进血管生成，但何时发生转变还不明确[9]。

表4　MMP-9、TSP-1共同高表达及临床病理参数对乳腺癌患无病生存率影响的多因素Cox回归风险比例模型

ER：雌激素受体；HER-2：人表皮生长因子受体2；TSP-1：凝血酶敏感蛋白1；MMP-9：基质金属蛋白酶9.B：回归系数；SE：标准误；Wald：χ2统计量；df：自由度；Sig：显著性检验值；Exp(B)：危险比；95%CI：95%可信区间.

本课题通过免疫组织化学检测方法对肿瘤细胞MMP-9阳性表达和肿瘤间质中TSP-1高表达分别与乳腺癌的各种常见临床参数进行分析，发现二者共同表达与肿瘤体积大(T3+T4)、腋窝淋巴结转移、病理分期高均密切相关。随后的生存分析发现，MMP-9、TSP-1阳性以及二者共同阳性表达病例相对于MMP-9、TSP-1阴性以及二者非共同阳性表达病例，其5年DFS及OS均显著降低，经过多因素Cox回归风险比例模型分析后，发现MMP-9、TSP-1共同阳性表达可显著降低乳腺癌患者的5年DFS。

表5　MMP-9、TSP-1共同高表达及临床病理参数对乳腺癌患者总生存率影响的多因素Cox回归风险比例模型

ER：雌激素受体；HER-2：人表皮生长因子受体2；TSP-1：凝血酶敏感蛋白1；MMP-9：基质金属蛋白酶9.B：回归系数；SE：标准误；Wald：χ2统计量；df：自由度；Sig：显著性检验值；Exp(B)：危险比；95%CI：95%可信区间.

近年来不少文献针对TSP-1和MMP-9表达同恶性肿瘤预后的关系进行了研究，结果并不完全一致，有的甚至相互矛盾。在TSP-1表达与肿瘤预后的研究中，部分肿瘤TSP-1的阳性表达同肿瘤的预后良好相关，例如胃癌、黏液表皮样癌中TSP-1阳性表达提示着患者预后良好[10-11]，而在膀胱癌中却是预后不良的指标[12]。此外Maeda等发现，在结直肠癌中，TSP-1阳性表达抑制肿瘤微血管形成，且阳性表达患者预后和肝转移发生率优于阴性表达的患者，是一个预后良好的指标[13]；然而在结直肠癌肝转移瘤中，TSP-1的表达却是预后不良的标记[14]。这可能和TSP-1在不同肿瘤微环境中发挥的调节血管生长、肿瘤间质塑造等发挥的作用不同有关。

MMP-9高表达常出现在浸润性癌症中，并成为恶性肿瘤的一个独立的预后因子。例如，在卵巢癌中，肿瘤细胞高表达MMP-9，其10年DFS也高[15]；但是在胃癌中，高表达MMP-9会降低患者与肿瘤相关的生存率[16]；食管癌中，MMP-9高表达常同肿瘤浸润深度、淋巴管瘤栓、淋巴结转移和肿瘤低分化密切相关[17]；而在前列腺癌中，MMP-9的高表达同肿瘤的高Gleason分级相关，同预后无关[18]。这些研究结果提示，TSP-1和MMP-9的阳性表达对恶性肿瘤的预后影响是依不同性质的肿瘤而改变的。

目前在通过免疫组织化学方法检测MMP-9蛋白在乳腺癌细胞中的表达情况和乳腺癌患者的预后关系的研究中，大多认为，肿瘤细胞中MMP-9蛋白表达越高，患者复发转移的可能性就越大，生存期越短。Giannelli和Zeng等学者通过免疫组织化学方法证实，高表达MMP-9的乳腺癌同肿瘤侵袭性强、预后不佳相关[19-20]。Puzovic等研究发现，乳腺癌细胞中，MMP-9、MMP-2和ETS-1共同高表达的患者是患者预后不良的一个独立影响因子，而MMP-9蛋白的表达并不是一个独立预后因子[21]。这个与笔者的研究结果类似，肿瘤细胞中MMP-9蛋白单一指标表达改变可能不足以影响患者的预后，联合其他预后指标共同表达的情况可能可以更准确预测乳腺癌患者的预后。对乳腺癌的基因表达谱进行大规模分析后表明，MMP-9基因表达高低和乳腺癌侵袭性密切相关，是乳腺癌一个重要的预后指标[22]。

本研究结果表明，通过较为简单的免疫组织化学检测，分析乳腺癌间质中TSP-1的表达可以抑制肿瘤组织中微血管生成，此外肿瘤间质中TSP-1与肿瘤细胞中MMP-9的共同高表达与乳腺癌患者的不良预后密切相关，二者共同表达的情况可以作为判断乳腺癌不良预后的指标之一。

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(编辑：何佳凤)

Expression and Prognostic Significance of TSP-1 and MMP-9 in Breast Cancer

FU Fangmeng, HUANG Jianping, HUANG Meng, WANG Chuan

Department of Breast Surgery, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China

ObjectiveTo investigate how the expression of Matrix metalloproteinases 9 (MMP-9) and Thrombospondin 1 (TSP-1) would be related to microvessel density (MVD) in breast cancer and its implication for the prognosis.MethodWith immunohistochemical staining method, the expression level of MMP-9 and TSP-1 were measured in tissues from 131 breast cancer patients.The relation between the two biomarkers and MVD and prognosis of breast cancer was analyzed.ResultsIn 131 breast cancer patients, expression of TSP-1 in stroma was negatively related to MVD (Spearman relation index=-0.241,P=0.006).The co-overexpression of MMP-9/TSP-1 was significantly related to tumor size, lymph node metastasis, and pathological stage(P<0.05).And survival analysis revealed that co-overexpression of MMP-9/TSP-1 was unfavorable prognostic factor in breast cancer.ConclusionMMP-9/TSP-1 co-overexpression was an independent unfavorable prognostic factor for breast cancer.

breast neoplasms; thrombospondin 1; matrix metalloproteinase 9; matrix metalloproteinases; capillaries; prognosis

2016-03-02

福建省卫生厅青年基金(2009-2-28)

福建医科大学 附属协和医院乳腺外科，福州350001

傅芳萌(1978-)，男，副主任医师，医学博士

王川. Email:chuanwang68@qq.com

R345.63； R345.9； R730.7； R737.9； R977.6

A

1672-4194(2016)05-0295-07