转录辅激活因子p300参与血管紧张素Ⅱ诱导的心房肌细胞Ikur离子通道重构的调控

曾珑 余声欢 肖海茵 肖菲菲 朱蕊 邓春玉 杨慧 邝素娟 饶芳 魏薇

心房颤动（房颤）是最常见的持续性心律失常之一［1］。由于人口老龄化和易患房颤的危险因素增加，房颤的发病率在过去几十年中持续增长，预计在接下来的20～30年内将增加2倍或3倍［2］。目前，抗心律失常药物（antiarrhythmic drugs，AAD）仍然是治疗房颤的基石之一。然而，有限的疗效以及容易引起室性心律失常使得AAD在房颤的治疗中很难令人满意。因此，需进一步阐明房颤的发病机制，以寻找更好的治疗策略。

超速延迟整流钾电流（ultra-rapid delayed rectifier K+current，Ikur）是一种心房特异性钾离子通道电流，它的分子基础是Kv1.5钾离子通道。有研究表明，Ikur在心房肌细胞复极的1～3期中起作用，但在心室肌细胞复极化过程中不起作用，因此Kv1.5被认为是治疗房颤且不伴有心室不良反应的有前景的分子靶点［3］。心房肌细胞电重构是房颤发生的主要病理机制之一，其基本特征是心房肌动作电位时程（action potential duration，APD）和心房有效不应期（atrial effective refractory period，AERP）缩短。已有研究表明Ikur抑制剂可以延长窦性心律和阵发性房颤患者的APD和AERP，从而有望降低房颤易感性［4］。但是Kv1.5蛋白在体内的调控机制还需要进一步研究探讨。

转录辅激活因子p300是一种主要的表观遗传调节因子，在心脏发育中起着重要作用［5］。p300水平显著升高参与小鼠心脏纤维化与心肌肥厚的形成［6］。在p300过表达转基因小鼠模型中，p300活性增加是引起心肌肥厚的必要条件［7］。由此可见p300在心脏纤维化以及心肌肥厚形成中发挥着重要作用，但是目前有关p300与心房电重构的研究较少。本课题组前期研究表明，p300通过调控L-型钙电流（L-type calcium current，ICa，L）在衰老相关的心房肌细胞电重塑中发挥重要作用。通过抑制p300可以明显改善老年小鼠心房肌细胞电重塑，使ICa，L上升，APD延长，从而降低老年小鼠房颤可诱发性［8］。但是p300是否参与调控心房肌细胞Kv1.5蛋白的表达，目前尚无相关报道。

血管紧张素Ⅱ（a ngiotensin Ⅱ，A ng Ⅱ）是肾素-血管紧张素系统（renin-angiotension aldosterone system，RAS）的主要肽之一，在房颤的发生发展中起重要作用［9］。最近的一项研究证明，Ang Ⅱ可以上调大鼠心房肌细胞中Kv1.5蛋白的表达［10］。此外，在Ang Ⅱ处理的乳鼠和成体鼠心肌细胞中观察到p300蛋白表达增加［11］。本研究旨在探讨p300是否参与调控Ang Ⅱ刺激下的心房肌细胞Kv1.5蛋白的表达，为房颤的防治提供新的策略。

1 材料与方法

1. 1 细胞实验

1. 1. 1 细胞来源 小鼠心房肌细胞株HL-1细胞由美国路易斯安那州立大学健康科学中心的Dr. William Claycomb惠赠。

1. 1. 2 细胞培养分组以及干预 HL-1细胞培养详见既往相关研究［12］。以正常HL-1细胞作为对照组，用不同浓度的Ang Ⅱ（0.1、1、10 μmol/L）干预细胞24 h。为了观察p300抑制剂姜黄素能否逆转Ang Ⅱ的作用，设置Ang Ⅱ+姜黄素组：在10 μmol/L Ang Ⅱ基础上给予姜黄素浓度梯度处理（5、10、15 μmol/L）。细胞预处理姜黄素6 h后再加入10 μmol/L Ang Ⅱ干预细胞24 h。根据说明书，非特异性siRNA和p300特异性siRNA（5′-CCTGTGCATCACTTGTTAT-3′，5′-G G T G C T T A G T A T C C T T C A T-3′，5′-GACAAGTCTTGGCATAGTA-3′）和lipo3000配制成终浓度50 nM后转染于HL-1细胞。

1. 1. 3 全细胞膜片钳记录 记录Ikur以及APD的内外液成分详见既往研究［8，12］。细胞贴壁后用目标电流外液覆盖细胞。拉制玻璃电极，使其灌注电极内液后电阻为2～5 MΩ。选取目标细胞进行高阻封接（阻抗＞1 GΩ），给予一个额外负压破膜后形成全细胞记录。电压钳模式用于记录Ikur以及膜电容，电流钳模式用于记录APD。实验过程中由pCLAMP 10.4软件程序发放刺激和收集数据。

1. 1. 4 Western Blot实验 用10% SDS-PAGE凝胶进行蛋白电泳后，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）。用TBST缓冲液配制5%脱脂奶粉进行室温封闭1 h后，加入一抗Kv1.5（1∶1000，Alonome）、p300（1∶1000，CST）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（1∶5000，proteintech）4℃孵育过夜。次日用TBST缓冲液洗膜3次，每次5 min。5%脱脂奶粉配制抗兔或抗鼠二抗（1∶1000），室温孵育1 h后再用TBST洗膜3次，每次5 min。以ImageJ软件测量蛋白灰度值，计算目的蛋白与内参灰度比值并进行统计学分析。

1. 1. 5 细胞免疫荧光 将HL-1细胞种于共聚焦皿中，用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗细胞3次，每次5 min。用4%多聚甲醛室温固定20 min，PBS清洗3次，每次5 min。用0.1%的Triton X-100室温孵育15 min通透处理。细胞破膜后再用PBS清洗3次，每次5 min。以4%山羊血清室温封闭30 min后，加入一抗p300（1∶100，CST）、Kv1.5（1∶200，Alonome）4℃孵育过夜。次日用PBS清洗细胞3次，每次5 min。加入PBS配制的荧光二抗（1∶500 Invitrogen，CST）室温避光孵育1 h。用PBS避光清洗3次，每次5 min。用4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）常温孵育5 min染核。在激光共聚物显微镜下观察并收集图像。

1. 2 动物实验

1. 2. 1 动物来源与分组 8～9周龄C57BL/6雄性小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司［许可证号：SCXK（湘）2019-0004］，饲养于华南理工大学实验动物中心。本研究所有动物实验已通过广东省人民医院（广东省医学科学院）的医学研究伦理审查（批准号：2019071H）。将18只C57小鼠随机分成3组，分别为对照组、Ang Ⅱ处理组及Ang Ⅱ+姜黄素饲养组，Ang Ⅱ给药剂量为1 000 ng/（kg·min），姜黄素给药剂量为50 mg/（kg · d）。Ang Ⅱ通过皮下置入Alzet微渗透泵持续给药6周；姜黄素造模前通过食物预喂养两周，每日1次，共8周。对照组以及Ang Ⅱ组同期给予单纯食物喂养。

1. 2. 2 小鼠Ang Ⅱ刺激模型建立 根据小鼠体重腹腔注射3%戊巴比妥（30 mg/kg），背部皮肤除毛，用75%酒精和聚维酮碘（碘伏）皮肤消毒，用剪刀剪开皮肤，钝性分离皮下，将渗透泵埋入皮下，缝合皮肤。Ang Ⅱ以1 000 ng/（kg · min）速度持续灌注6周。姜黄素通过食物预喂养2周直至造模结束，共8周。

1. 2. 3 小鼠心房快速起搏 小鼠心房起搏方法详见既往相关研究［8］。设置刺激脉宽为2 ms，刺激频率为50 Hz，刺激时长为6 s，每只小鼠重复刺激10次，观察并记录房颤持续时间以及发作次数。房颤定义为心电图上P波消失，代之以大小不等、间隔不均、形态不一的f波，RR间期不等，持续时长1 s以上。房颤诱发率定义为诱发次数与总刺激次数的比值。房颤持续时间定义为自诱发起始到出现第一个窦性P波之间的时距。

1. 3 主要试剂与仪器

We s t e r n Bo l t中p 30 0 抗体购自美国C e l l Signaling Technology公司，Kv1.5抗体购自以色列Alomone La bs公司，GAPDH抗体购自美国proteintech公司，RIPA裂解液购自中国碧云天生物公司，硝酸纤维素膜PVDF膜购自德国Millipore公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG购自美国Invitrogen公司。荧光二抗购自美国Cell Signaling Technology公司。p300 siRNA由中国锐博生物技术有限公司构建。膜片钳试验的MultiClamp 700B膜片钳放大器及附件以及数据采集和分析系统均购自美国Axon Instruments公司。小鼠造模Alzet渗透泵购自美国Alzet公司，姜黄素购自美国Sigma公司。

1. 4 统计学分析

采用S PSS 2 2.0统计软件进行数据分析，GraphPad Prism 8绘图软件进行绘图。计量数据使用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，多组之间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 细胞实验

2. 1. 1 Ang Ⅱ处理的HL-1细胞中p300和Kv1.5蛋白表达情况 A n g Ⅱ刺激H L-1细胞可以使p300以及K v1.5蛋白呈浓度梯度上升，并且在1 μmol/L和10 μmol/L时差异有统计学意义（均P＜0.05，图1 A～B）。免疫荧光结果显示，与对照组相比，10 μmol/L Ang Ⅱ刺激HL-1细胞后可以使p300 （核内） 和Kv1.5（细胞膜）蛋白荧光强度增强（图1 C）。

图1 Ang Ⅱ处理后HL-1 细胞p300 和Kv1.5 蛋白的表达 A～B. Ang Ⅱ浓度梯度干预HL-1 细胞后p300、Kv1.5 蛋白表达；C. Ang Ⅱ干预HL-1 细胞后p300 以及Kv1.5 蛋白免疫荧光图（×100），绿色信号代表p300 蛋白，红色信号代表Kv1.5 蛋白，细胞核用DAPI 染色（蓝色）

2. 1. 2 姜黄素干预Ang Ⅱ处理的HL-1细胞表达情况 不同浓度的姜黄素处理HL-1细胞可以使p300、Kv1.5蛋白表达水平均呈浓度依赖性下降，在10 μmol/L和15 μmol/L时差异具有统计学意义（P＜0.01，图2 A～B）。此外，膜片钳技术结果显示，与对照组相比，Ang Ⅱ刺激处理的HL-1细胞Ikur电流密度明显升高（P＜0.01，图2 C～D），APD90、APD70、APD50均明显缩短（均P＜0.05，图2 E～F）。

图2 姜黄素干预对Ang Ⅱ处理后HL-1 细胞的影响 A～B. 姜黄素干预Ang Ⅱ处理后HL-1 细胞p300 和Kv1.5 蛋白表达（*P ＜0.05，**P ＜0.01）；C～D. 各组细胞的Ikur 电流代表图以及Ikur 电流密度统计图（与对照组比较，**P ＜0.01；与Ang Ⅱ处理组比较，##P ＜0.01）； E～F. 各组细胞的动作电位时程代表图以及APD90、APD70、APD50 统计图（与对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与Ang Ⅱ处理组比较，##P ＜0.01）

2. 1. 3 p300 siRNA干预对Ang Ⅱ处理的HL-1细胞Kv1.5蛋白水平以及Ikur电生理特性的影响 转染p300 siRNA后p300、Kv1.5蛋白表达水平均显著降低（均P＜0.05，图3 A～B）。膜片钳结果显示，与单纯Ang Ⅱ刺激组相比，siRNA敲低p300后Ikur电流密度明显降低（P＜0.01，图3 C、E），而且APD90、APD70、APD50均有所延长（均P＜0.01，图3 D、F）。

图3 p300 siRNA 干预对Ang Ⅱ处理后HL-1 细胞的影响 A～B. HL-1 细胞Ang Ⅱ处理同时给予p300 siRNA 干预后，p300 以及Kv1.5 蛋白表达（*P ＜0.05）；C，E. 各组细胞Ikur 电流图以及Ikur 电流密度统计图（与Ang Ⅱ+ NC 组比较，**P ＜0.01）；D，F. 各组细胞的动作电位时程代表图以及APD90、APD70、APD50 统计图（与Ang Ⅱ+ NC 组比较，**P ＜0. 01）

2. 2 动物实验——姜黄素对小鼠心房组织Kv1.5蛋白的表达以及小鼠房颤的影响

Masson染色结果显示（图4 A），与对照组相比，Ang Ⅱ处理组小鼠心房组织胶原表达增多，纤维化程度加重，而加入姜黄素干预后心房组织胶原表达减少，纤维化程度减轻。Western Blot结果显示，与对照组相比，Ang Ⅱ处理组心耳组织的p300以及钾离子通道Kv1.5蛋白表达增加（p300：P＜0.01，Kv1.5：P＜0.05，图4 B～C），而p300抑制剂姜黄素干预后可以使p300和Kv1.5蛋白降至对照组水平（p300：P＜0.01，Kv1.5：P＜0.05，图4 B～C）。3组小鼠分别予颈静脉心房快速起搏，观察房颤的可诱发性，结果显示，与对照组相比，Ang Ⅱ处理组显著提高房颤诱发率（P＜0.01），而姜黄素干预后可以使房颤诱发率显著下降 （P＜0.01，图4 D～F）。以上结果初步提示AngⅡ可能通过p300诱导的钾离子通道Kv1.5蛋白表达上升，引起小鼠心房肌细胞电重塑，进而使小鼠房颤诱发率升高。

3 讨论

本研究主要结果有：（1） 在动物实验中，与对照组相比，Ang Ⅱ处理组小鼠左心耳组织中p300以及钾离子通道蛋白Kv1.5表达含量明显上升，且AngⅡ处理组房颤可诱发性明显升高。在p300抑制剂姜黄素的干预下，p300以及Kv1.5蛋白表达水平均降至对照组水平，并且可以明显降低小鼠的房颤诱发率。（2）在细胞水平，Ang Ⅱ刺激HL-1细胞可以使p300以及Kv1.5蛋白呈浓度依赖性上升，Ikur电流明显上升和APD明显缩短。通过p300抑制剂姜黄素或p300 siRNA抑制p300活性和表达则可以逆转由于Ang Ⅱ刺激诱导的p300以及Kv1.5蛋白表达，并且可以使Ikur电流降低，APD延长。本研究结果证明p300参与了Ang Ⅱ引起的心房肌细胞Kv1.5蛋白表达上升，从而引起Ikur上升以及APD缩短。

Ikur在心房肌细胞的复极化过程中起到重要作用［3］。由于其心房特异性表达，靶向抑制Ikur被认为是房颤安全有效的治疗靶点。研究表明Ikur特异性抑制剂4-氨基吡啶可以延长从冠状动脉旁路移植术或心脏手术患者心房分离出的心房肌细胞的APD90，并可以显著延长AERP而不会影响心室不应期，从而有望降低房颤易感性的疗效［4］。有研究报道，在原代分离的大鼠心肌细胞中分拣微管连接蛋白17（sorting nexin 17，SNX17）可以促进Kv1.5从质膜到早期核内体的内吞分选。SNX17半敲除基因大鼠表现为细胞膜上Kv1.5蛋白表达升高，Ikur密度增加，最终导致APD缩短，大鼠的房颤易感性升高［13］。最近一项研究报道，高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型房颤易感性增加的机制主要为通过NLRP3介导的Kv1.5蛋白表达上调，从而引起AERP和APD的缩短，而钠离子通道和L-型钙离子通道在组间差异无统计学意义［14］。以上结果证明，Kv1.5蛋白可能是一个有效治疗房颤的分子靶点，因此研究Kv1.5蛋白在细胞内的调控机制具有重要意义。

转录辅激活因子p300是一种具有乙酰转移酶活性的表观遗传调控分子，调控多种基因的表达［15］。多项研究表明，p300可以通过激活转化因子（transforming growth，TGF）-β/Smad通路参与心脏纤维化以及心肌肥厚形成的过程［16-17］。又有研究表明，Ang Ⅱ可以通过活性氧（reactive oxygen species，ROS）依赖的途径激活TGF-b1/P-Smad2/3通路从而引起乳小鼠心房肌细胞Kv1.5蛋白表达上升［14］。另有研究表明，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4 （nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4）介导的ROS参与了Ang Ⅱ诱导的乳小鼠心房肌细胞Kv1.5蛋白表达上升［18］。但是p300蛋白是否参与Ang Ⅱ诱导的Kv1.5蛋白表达上升，目前尚无相关报道。本研究发现，Ang Ⅱ可以使C57小鼠心房组织p300蛋白表达增加，同时钾离子通道Kv1.5蛋白表达也增加，心房肌细胞出现电重塑。而给与p300抑制剂姜黄素干预后，可以逆转以上改变。姜黄素还可使Ang Ⅱ处理组小鼠的房颤诱发率降低。在细胞实验中，Ang Ⅱ可以使HL-1细胞的p300以及Kv1.5蛋白表达呈浓度梯度上升，Ikur电流升高，APD缩短。在给与姜黄素或者p300 siRNA干预后，可以逆转以上改变。其机制可能为p300蛋白通过调控心房组织纤维化间接影响电重构（图4 A）。有研究表明，p300蛋白可以调控成纤维细胞NOX4基因的表达［19］。因此p300蛋白是否通过调控心房肌细胞NOX4基因的表达，进而通过ROS依赖的途径影响Kv1.5蛋白的表达，仍需要进一步实验证明。以上结果证明了p300蛋白可能介导了Ang Ⅱ引起的心房肌细胞Kv1.5蛋白表达上升，参与了心房的电重塑，从而导致房颤易感性增加。

此外，本研究具有以下几个局限性：（1）本研究只关注了一种钾离子通道（Ikur）和p300蛋白之间的关系，没有研究其他的离子通道是否也受p300蛋白调控。因此Ang Ⅱ引起的HL-1细胞APD缩短可能不仅仅由升高的Ikur一种电流导致。（2）p300蛋白影响Kv1.5蛋白表达的确切机制尚不清楚。（3）本研究使用的是HL-1细胞系，而非原代心房肌细胞。尽管HL-1细胞和原代心房肌细胞之间有许多共同的特性，但它们的结果可能有所差异。

综上所述，本研究在动物水平验证了Ang Ⅱ可以使小鼠心房肌组织p300蛋白和Kv1.5蛋白表达上升。并且在细胞水平验证了p300蛋白和Kv1.5蛋白之间的调控关系。靶向调控p300蛋白可以抑制心房肌细胞钾离子通道蛋白Kv1.5表达，缓解Ang Ⅱ引起的心房肌细胞电重塑，降低房颤的易感性。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突