超声诊断对木瓜蛋白酶致早期兔膝骨关节炎模型可行性研究

陆瑞娜，梁子聪

(1.黔南民族医学高等专科学校附属医院，贵州 都匀 558000；2.黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558013)

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是临床常见的骨关节疾病，其疾病机理是炎症所致膝关节滑膜、软骨及其周围组织的退行性变[1]。炎性因子在膝关节软组织和软骨中的表达是本病的主要特征，例如炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α、金属蛋白酶等[2-5]。超声作为一种无创、无辐射的诊断手段在临床腹腔脏器疾病、体表肿物等应用广泛。但超声在动物骨关节实验的应用报道较少，本实验比较炎性因子、关节病理变化以探讨超声诊断在KOA早期病变中的诊断效能。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 木瓜蛋白酶(北京索莱宝)；MMP-3试剂盒(北京诚林)；JA10002型电子天平(上海精天)；MR-96A型酶标仪(深圳迈瑞)；IU22型超声(荷兰飞利浦)；ASP300 S型全封闭式组织脱水机、RM2265型全自动轮转式切片机、HI1210型摊片机、DM750型光学显微镜(德国Leica)。

1.2 动物分组与造模 普通级六月龄日本长耳白兔32只，♀，体质量(3.0±0.5)kg，由长沙天勤生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2014-0010。按随机法将实验动物分成2组，分别为对照组、造模组，每组16只。适应性饲养1周，普通饮食。除正常组外，采用木瓜蛋白酶关节腔内注射法建立兔膝骨关节炎模型。

1.3 观察指标

1.3.1 血清MMP-3含量的检测 两组兔分别于造模后第2、4周于兔耳缘静脉取血。血清标本采集：所得血液注入无菌EP管中离心(3 000 r/min，4℃)10 min，吸取上清液后置于-20℃冰箱中待测。严格按照说明书操作，用酶标仪检测两组兔血清MMP-3含量。

1.3.2 病理学评分 两组兔分别于造模后2、4周处死，每组各8只，取下各组兔右侧膝关节关节软骨及滑膜软组织标本，以4%多聚甲醛溶液中固定，10%EDTA脱钙2周，石蜡包埋，切片，HE染色，封片，采用光学显微镜观察，并按改良Mankin's评分标准[6]进行评分。

1.3.3 超声检查 造模后第2、4周按3.5 ml/kg剂量腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉对实验兔进行麻醉。实验兔以平卧位固定于操作台，膝关节采取自然半屈曲位，剔除膝关节毛发。超声观察膝关节滑膜、关节间隙、软骨等情况，在彩色多普勒血流显像(CDFI)模式，观察滑膜内血流信号分布。参照文献方法[7]，对滑膜血流灌注进行分级评价。具体分级标准如下：0级，滑膜内无血流信号；1级，增生的滑膜内见点状彩色血流信号；2级，增生的滑膜内见条状彩色血流信号，充盈面积不到滑膜面积的50%；3级，增生的滑膜内见条状丰富彩色血流信号，充盈面积为滑膜面积50%以上。

1.3.4 免疫组化观察膝关节软骨II型胶原、骨形态发生蛋白的表达的比较 切片脱水后，柠檬酸修复抗原；滴加阻断剂孵育10～30 min；滴加一抗，4℃孵育过夜，滴加二抗，37℃孵育30 min，滴加DAB显色，脱水、透明、中性树胶封片。置于40倍显微镜下，每例取软骨退变区随机选取8个视野，测定阳性颗粒平均灰度值?

2 结果

2.1 两组兔血清MMP-3含量及改良Mankin's评分结果的比较 由表1可知，与正常组比较，模型组兔在造模2、4周时血清MMP-3的含量及改良Mankin's评分明显增高(P<0.05)。

表1 两组兔不同造模时间节点血清MMP-3含量、改良Mankin's评分(分)结果的比较

2.2 两组兔超声检查的比较 由表2可知，与正常组比较，模型组兔在造模2、4周时超声SZKUDLAREK评分明显增高(P<0.05)。

表2 两组兔不同造模时间节点超声检测结果的比较

2.3 免疫组化观察膝关节软骨II型胶原、骨形态发生蛋白的表达的比较 由表3可知，与正常组比较，模型组兔在造模2、4周时膝关节软骨II型胶原相对表达量明显下降、而骨形态发生蛋白的相对表达量明显增高(P<0.05)。

2.4 Spearman相关性分析结果 造模2周时，血清MMP-3、病理学评分、膝关节软骨II型胶原、骨形态发生蛋白的表达与超声学评分的Spearman相关性检验rS值分别为0.662、0.685、0.698、0.784(P<0.05)；造模4周时，Spearman相关性检验rS值分别为0.762、0.752、0.717、0.802(P<0.05)。分析结果显示：MMP-3、病理学评分、膝关节软骨II型胶原、骨形态发生蛋白的表达、超声评分均具有相关性。

表3 两组兔不同造模时间节点免疫组化观察膝关节软骨II型胶原、骨形态发生蛋白的表达结果的比较

3 讨论

膝骨关节炎是一种膝关节常见的以慢性滑膜炎症、软骨损伤退化、软骨下骨硬化及骨赘形成为特征的退行性疾病，其临床症状主要是膝关节疼痛及活动功能障碍。根据研究调查，在全球范围内超过65岁的人群中至少有50%遭受该疾病的困扰[8-9]。而中国每年在骨关节炎的医疗费用支出在逐年增加[10]。目前对膝骨关节炎的研究，该疾病的早期干预治疗有利于减轻关节退变，减少后期膝关节手术概率，对减轻患者痛苦，降低医疗费用具有不可忽视的影响。研究发现，氧自由基、MMP- 3等多种活性因子使得软骨细胞老化、凋亡，软骨基质降解，诱导KOA的发生发展[11-12]。其中，MMP- 3在KOA软骨细胞中表达显著增加，随着病变加重更加明显[10]。有研究报道，KOA患者合成保护性因子Ⅱ型胶原、蛋白聚糖等软骨基质显著减少，导致软骨细胞形成障碍，而软骨细胞自我修复使得BMP的表达上升，所以II型胶原减少，骨形态发生蛋白增高是骨关节炎发生的标志[13-15]。

木瓜蛋白酶是已知和被证实的可诱导蛋白多糖分解代谢的介质，可造成关节滑膜炎症及关节软骨退变[16]。Shen等[17]研究报道，在兔左侧膝关节腔注射0.5 ml浓度为1.6%的木瓜蛋白溶液第1周后，病理学检查发现膝关节软骨内蛋白多糖含量测定较健侧有所降低的，达到第4周时蛋白多糖减少最为明显；并且正常关节软骨细胞明显减少，细胞外基质逐渐出现纤维化，为早期软骨退变的表现。陈达等[18]同样使用木瓜蛋白酶注射方法进行造模，第4周后肉眼可见膝关节腔滑膜增生变厚，软骨颜色灰黄、变硬，关节面软骨变薄、粗糙、光泽度降低，胫骨平台及股骨髁软骨广泛磨损，胫骨平台内侧缘见骨赘形成，光学显微镜下组织结构纹理模糊，免疫组化Ⅱ型胶原表达量降低。

炎症因子在动物造模过程中不利于动态评价和形态观察，而DR、CT等影像学难以观察软骨、滑膜等软组织。超声不但可以观察关节腔的滑膜、关节腔、软骨等变化，而且检查时不额外增加关节创伤[19-21]。于静等[22]研究高频超声对类风湿性关节炎早期的敏感程度，以病理为标准，发现与 MRI 比较，超声在检测积液上优于MRI，在检测滑膜上，超声较 MRI 更敏感、简便，并且高频超声还能清楚观察类风湿关节炎大鼠早期滑膜的形态和位置。因此，超声可作为观察滑膜病变一种较灵敏的影像学检查方法，且与其他影像学检查结合起来，可以提高对RA 疾病的早期诊断率。本实验结果显示，与正常组比较，模型组兔在造模2、4周时血清MMP-3的含量明显增高(P<0.05)，改良Mankin's评分标准的含量明显增高，膝关节软骨II型胶原相对表达量明显下降、而骨形态发生蛋白的相对表达量明显增高(P<0.05)，证实动物见模成功，而造模2、4周时超声SZKUDLAREK评分明显增高。Spearman相关性检验结果显示，造模2、4周时，血清MMP-3、病理学评分、膝关节软骨II型胶原、骨形态发生蛋白的表达与超声学评分呈相关性(P<0.05)，说明超声检查结果与血清炎性因子、关节软骨组织因子表达及病理评分结果呈一致性。综上所述，超声检查可以作为木瓜蛋白酶致早期兔膝骨关节炎模型有效的、无创的检查方式。