鹿角壮骨胶囊对去卵巢骨质疏松大鼠骨细微结构、骨代谢及OPG/RANK/RANKL信号通路的影响

江 勇，任 一，胡建山，梁子聪

(1.黔南民族医学高等专科学校第二附属医院，贵州 都匀 558000；2.黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558013)

骨质疏松是以骨密度降低及其显微结构发生变化为主要特征的一类型疾病。骨质疏松发病率与年龄、性别呈明显相关，尤其是绝经后妇女由于卵巢功能衰退，雌激素水平降低，骨质破坏严重，骨质脆性增加，导致骨折发生[1-2]。在我国随着老龄化加重，骨质疏松症成为了危害公共健康严重问题之一[3]。对于骨质疏松的治疗现以使用骨吸收抑制剂、骨形成促进剂等治疗为主，虽然药物疗效确切，是目前医学界重要的课题之一[4]。“鹿角壮骨胶囊”是黔南州著名民族医胡建山教授治疗骨质疏松症的经验方。本实验探讨鹿角壮骨胶囊对去卵巢大鼠骨细微结构及骨代谢影响的机制，为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 鹿角壮骨胶囊由黔南州中医医院制剂科提供(批准文号：黔药制2013003号，规格：0.45 g/粒)，迪巧小儿碳酸钙D3颗粒(碳酸钙0.75 g/袋，国药准字J20090021)，血清钙、血清磷、酸性磷酸酶、骨钙素试剂盒购自南京建成生物工程研究所。大鼠骨保护素(osteoprotegerin，OPG)和核因子κB受体活化因子配(Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand，RANKL)免疫组化一抗、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。ASP300 S型全封闭式组织脱水机、RM2265型全自动轮转式切片机、HI1210型摊片机、DM750型光学显微镜(德国Leica)，酶标仪(深圳迈瑞)等。

1.2 实验动物与分组 实验选用6个月龄 SD(清洁级)雌性大白鼠60只，体质重(200±20)g，分笼饲养。造模前数字随机法将大鼠其分成假手术组、模型组、阳性组(碳酸钙)、鹿角壮骨胶囊低剂量组(低剂量组)、鹿角壮骨胶囊中剂量组(中剂量组)及鹿角壮骨胶囊高剂量组(高剂量组)，每组10只。

1.3 造模及药物干预 模型组、西药组、鹿角壮骨胶囊低、中、高剂量组参考文献方法建立阳虚型骨质疏松大鼠模型，即去势法+糖皮质激素：雌性大鼠予卵巢切除，按20 mg/kg的剂量间歇肌肉注射氢化可的松诱导骨质疏松模型，诱导时间为2个月。假手术组仅予腹部切开，随后缝合切开，不予激素诱导。造模后第二天，分别灌胃给予对应药液(人与大鼠体表面积换算等效剂量换算)，西药组给予碳酸钙(104.19 mg/(kg·d)，低剂量组给予鹿角壮骨胶囊药粉(0.432 g/(kg·d)，中剂量组给予鹿角壮骨胶囊药粉(0.864 g/(kg·d)，高剂量组给予鹿角壮骨胶囊药粉(1.728 g(kg·d)；假手术组与模型组给予蒸馏水。给药1次/d，连续给药3个月。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 骨代谢生化指标检测、血清学指标及骨基质成分检测 麻醉大鼠后，眼眶采血，收集血液，分离血清，测定血清钙、磷、酸性磷酸酶和骨钙素含量。

1.4.2 股骨细微结构 取大鼠右侧股骨，制作HE切片，置于显微镜下观察，采用图像系统采集平均骨小梁面积百分数(percent trabecular area，%Tb.Ar)、平均骨小梁厚度(trabecular thick ness，Tb.Th)、平均骨小梁分离度(trabecular separation，Tb.Sp)的数值。

1.4.3 OPG及RANKL蛋白表达 切片脱蜡，修复抗原，加OPG及RANKL一抗过夜，滴加二抗，DAB显色后，苏木素轻度复染，脱水、透明、封片，显微镜观察。采用图像分析系统测定着色部位的平均光密度值，作为OPG及RANKL蛋白的表达强度。

1.5 统计学方法 数据分析采用SPSS 20.0统计软件进行，计量资料以“均数±标准差”表示，采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清钙、血清磷、酸性磷酸酶、骨钙素的检测结果 与假手术组比较，模型组大鼠血清钙、血清磷、酸性磷酸酶、骨钙素的含量均明显下降(P<0.05)。与模型组比较，阳性组和高剂量组大鼠血清钙、血清磷的含量均不同程度上升(P<0.05)，而阳性组和中高剂量组血清酸性磷酸酶、骨钙素明显上升(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠血清钙、血清磷、酸性磷酸酶、骨钙素的结果比较

2.2 各组大鼠骨细微结构的检测结果 与假手术组比较，模型组大鼠平均骨小梁面积百分数、平均骨小梁宽度明显下降(P<0.05)，而平均骨小梁分离度明显增高(P<0.05)。与模型组比较，阳性组及中高剂量组平均骨小梁面积百分数、平均骨小梁宽度明显增高(P<0.05)，而平均骨小梁分离度明显下降(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠Tb.Ar、Tb.Th、Tb.Sp及OPG、RANKL表达的结果比较

2.3 各组大鼠骨组织OPG、RANKL的免疫组化检测结果 从图1、2看出，与假手术组比较，模型组大鼠软骨OPG表达明显下降(P<0.05)，而RANKL表达明显增高(P<0.05)。与模型组比较，阳性组及中高剂量组OPG表达明显增高(P<0.05)，而RANKL表达明显下降(P<0.05)。

图1A假手术组OPG 图1B模型组OPG 图1C阳性组OPG

图1D低剂量组OPG 图1E中剂量组OPG 图1F中剂量组OPG

图2D低剂量组RANKL 图2E中剂量组RANKL 图2F中剂量组RANKL

3 讨论

骨质疏松症是老年常见病之一，女性发病率高于男性，原因是女性更年期后，机体雌激素水平的降低，随着年龄的增加，女性的雌激素分泌水平下降更加明显，导致骨质疏松症的发病[5]。卵巢切除联合糖皮质激素建立大鼠骨质疏松模型，与本病发病机理相似，是目前首选的骨质疏松动物模型[6]。骨微细结构是反映骨质疏松症的重要指标，骨小梁面积百分数、骨小梁厚度、骨小梁间距等反映单位面积内骨小梁结构状况，对骨质疏松症的判断起重要作用[7]。本实验通过卵巢切除联合糖皮质激素建立大鼠骨质疏松模型，模型组大鼠在骨小梁面积百分数、骨小梁厚度、骨小梁分离度等指标较假手术组具有明显差异，骨质丢失明显，说明造模成功。

骨质疏松症在中医学中属于“骨萎”的范围，其病因主要为年老体衰、肝肾亏虚所致[8]。研究认为，中医补肾疗法可以加强下丘脑垂体性腺轴功能，对钙离子等在肠道的吸收及细胞机制中钙磷代谢平衡中起重要作用，促进骨质形成，减少骨的破坏[9]。骨钙素通过富集成骨细胞，促进骨形成和骨的钙化作用。而破骨细胞能产生和分泌酸性磷酸酶，参与骨矿质降解过程，是评价破骨细胞功能和骨吸收的特异性指标[10]。近年研究发现，OPG/RANK/RANKL信号通路是参与调节骨重建的最重要的分子系统之一，OPG和RANKL是两种作用完全相反的破骨细胞调控系统的重要中介物质[11]。据实验证实，骨保护素被激活后，可以抑制破骨细胞骨分化，诱导破骨细胞凋亡。而成骨细胞表达的RANKL能与破骨细胞前体细接触，促进破骨细胞的生成[12]。因此，除了血清钙磷等代谢指标外，OPG/RANK/RANKL信号通路成为了中医药治疗骨质疏松症的作用机理研究的重要指标之一。鹿角壮骨胶囊以鹿角胶为君药，主归肝、肾经，起到补肾强骨功效。臣以骨碎补、熟大黄、增强君药补益肝肾之功，佐以黄芪、当归、血竭、炒土鳖、锻自然铜、白术、川芎等多味中药共凑益气补血、填精生髓之功效。现代医学研究证实，骨碎补可调节BMSCs细胞OPG、RANKL的表达,激活OPG/RANKL/RANK信号通路抑制破骨细胞的分化和成熟[13]。黄芪和当归亦可通过OPG/RANKL/RANK信号通路，上调OPG、VEGF164表达，下调RANKL表达,降低RANKL/OPG比降低骨细胞死亡率、抑制破骨细胞过度活动[14]。本实验结果显示，与模型组比较，阳性组和高剂量组大鼠血清钙、血清磷的含量均不同程度上升(P<0.05)，而阳性组和中高剂量组血清酸性磷酸酶、骨钙素明显上升(P<0.05)，阳性组及中高剂量组平均骨小梁面积百分数、平均骨小梁宽度明显增高(P<0.05)，而平均骨小梁分离度明显下降(P<0.05)，阳性组及中高剂量组OPG表达明显增高(P<0.05)，而RANKL表达明显下降(P<0.05)。因此可以说明，鹿角壮骨胶囊可以通过调节OPG/RANK/RANKL信号通路，提高骨OPG蛋白表达及抑制RANKL蛋白表达，调节大鼠机体钙磷代谢，进而通过抑制破骨细胞分化，减少骨微结构中骨量的丢失来预防绝经后骨质疏松症的发展。

综上所述，早期使用中高剂量鹿角壮骨胶囊干预，能减少骨微细结构破坏，可以有效预防骨质疏松症的发生。其作用原理可能与鹿角壮骨胶囊调节OPG/RANK/RANKL信号通路，稳定机体钙磷代谢相关。