桑叶脱氧野尻霉素的提取及其特性

薛 婷 婷， 孙 庆 元， 王 化 旋， 张 洪 达

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，DNJ)是哌啶类多羟基生物碱，广泛存在于桑树的各个组织中，其中桑叶中含量最高[1-2]。DNJ可作为肠道葡萄糖苷酶的抑制剂[3]，抑制餐后血糖浓度的急剧升高[4-5]。传统煎药法即水提法，简单、经济，但DNJ得率低，同时浸取出水溶性糖类、蛋白等杂质较多，给后续纯化带来困难[6]。酸提取法是利用DNJ为生物碱类化合物与酸形成可溶性盐的特性，DNJ从植物细胞壁渗出[7]，同时酸溶液可使植物细胞壁软化，因此，DNJ的提取率明显提高，但受酸的影响提取液浓缩比较困难。有机溶剂提取法是目前提取DNJ常用的方法[8]，一般选用与水互溶的有机溶剂，这种方法提取效率高，而且提取液不易发霉变质[9]，但高毒有机溶剂的残留影响了DNJ的应用。本研究选用低毒、环保、可回收的乙醇浸提法[10]，对所提取的DNJ特性进行分析，以期为DNJ的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

桑叶，采自金州华家村；DNJ标准品，上海金穗生物科技有限公司，纯度大于99%；蔗糖酶，上海百福进出口贸易公司；Wagner试剂；DNS；醋酸、醋酸钠、乙醇、稀硫酸、氢氧化钠、葡萄糖、蔗糖、石油醚、正丁醇、活性炭等均为分析纯。

1.2 方 法

1.2.1 最大吸收波长的确定

取1 mL 0.4 g/L的DNJ标准溶液，与33 μL Wagner试剂混合，定容于25 mL容量瓶，蒸馏水为对照，在240～450 nm扫描，确定DNJ的最大吸收波长[11-12]。

1.2.2 DNJ标准曲线的绘制

取0.02 mg/mL的DNJ标准溶液0.16、0.24、0.32、0.40、0.48 mL测定吸光度，绘制标准曲线，得到DNJ质量浓度与吸光度的回归方程：y=0.036 9x-0.031 4，R2=0.992 6。

1.2.3 不同因素对DNJ提取的影响

称取60目桑叶粉末4 g于三角瓶中，温度40 ℃、pH 4，按照料液比(g/mL)1∶10，分别加入体积分数为0、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，确定乙醇体积分数。

按照乙醇体积分数50%、温度40 ℃、pH 4，料液比分别为1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1：14、1∶16，确定料液比。

按照乙醇体积分数60%、料液比1∶10、温度40 ℃，pH 3、4、5、6、7、8，确定pH；

按照乙醇体积分数60%、料液比1∶10、温度40 ℃，提取温度分别为30、40、50、60、70、80 ℃，确定温度。

分别于120 r/min水浴恒温振荡器反应30 min，重复3次，过滤反应液，将滤液离心得到上清液，对上清液碱化，活性炭脱色、过滤，将滤液置于蒸发皿中，50 ℃蒸至恒重，蒸馏水定容至100 mL，测定DNJ质量浓度[13]。

1.2.4 正交试验

通过正交试验进一步确定DNJ提取的最佳工艺参数，L9(34)正交试验方案见表1。

表1 正交试验因素水平表

1.2.5 DNJ的浓缩纯化

将最佳工艺提取的样液，与石油醚按体积比1∶1 加入250 mL分液漏斗中，多次振荡后静置过夜，重复脱脂3次，下层样液倒入蒸发皿中，50 ℃ 恒温蒸至恒重，得到固形物，用蒸馏水定容于100 mL容量瓶中，进行测定。将石油醚脱脂后的样液与水饱和正丁醇按1∶1比例加入到250 mL分液漏斗中，多次振荡后静置过夜，重复萃取3次，合并上层样液后倒入蒸发皿中，50 ℃恒温蒸至恒重，得到固形物，蒸馏水定容于100 mL 容量瓶中，测定酶活和DNJ质量浓度[14-15]。DNJ质量、得率及纯度的计算公式[16]为

m=ρnV

得率=m/m0×100%

纯度=m/m1×100%

式中：ρ为根据标准曲线计算出提取液中DNJ的质量浓度，μg/mL；n为稀释倍数，V为配成溶液的体积，mL；m0为桑叶质量，g；m1为固形物质量，g。

1.2.6 蔗糖酶抑制活性检测

1.2.6.1 葡萄糖标准曲线的绘制

对不同质量浓度的葡萄糖标准溶液进行测定，以葡萄糖的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得葡萄糖的回归方程：y=1.109x-0.019，R2=0.995 0。

1.2.6.2 蔗糖酶反应速率的测定方法

将用0.2 mol/L pH=4.6的醋酸-酸酸钠缓冲溶液配制7.5 U/mL的蔗糖酶液、底物蔗糖溶液于35 ℃水浴锅内预热10 min。向蔗糖溶液中加入20 μL DNJ，蒸馏水为对照，加20 μL蔗糖酶稀释液，搅拌反应3 min，立即取1 mL反应液于100 ℃沸水浴灭活10 min[17]。DNS反应体系为300 μL反应液与300 μL DNS混合，沸水浴反应5 min，加水至4.5 mL，于OD540测定吸光度。

根据底物蔗糖不同浓度，绘制酶反应速率曲线。

1.2.6.3 纯化的DNJ对蔗糖酶的抑制作用

底物蔗糖浓度在一定的条件下，以不同质量浓度的DNJ溶液与等体积的蔗糖酶溶液混合反应，按照“1.2.6.2”方法测定酶反应速率。

在35 ℃、pH=4.6条件下，以蔗糖为底物，与对照相比，DNJ每分钟使蔗糖酶少生成的还原糖的量定义为DNJ的1个抑制单位，μg/(mL·min)。

1.2.6.4 蔗糖酶抑制率计算

抑制率=[A0-(A1-A2)]/A0×100%

式中：A0为对照组吸光度；A1为试验组吸光度；A2为背景校正值[18]。

2 结果与讨论

2.1 DNJ最大吸收波长的确定

DNJ分子结构中缺少吸光基团，在紫外、可见光波段都没有吸收峰值。将DNJ与Wagner试剂反应，生成棕色络合物改变了DNJ的吸光特性[19]。如图1所示，DNJ在284和356 nm处都有吸收峰。在284 nm处峰高而窄，而356 nm处峰低而宽。本研究选取284 nm为DNJ的理想吸收波长。

图1 DNJ的紫外最佳吸收光谱

2.2 不同单因素对DNJ提取效果的影响

如图2(a)所示，随着乙醇体积分数提高，DNJ得率也相应增大。在乙醇体积分数60%时，DNJ得率达到0.710 mg/g；之后有所下降。

如图2(b)所示，随料液比的提高，DNJ得率明显上升；料液比在1∶10时，DNJ得率达到0.653 mg/g，此后升高不明显。

如图2(c)所示，当提取液pH较小时，随着pH升高，DNJ得率也相应增高。pH=4时，DNJ得率最高达到0.720 mg/g；之后DNJ得率不断下降。

如图2(d)所示，随着温度的升高，DNJ得率不断提高，在70 ℃时，DNJ得率达到0.697 mg/g；超过70 ℃后，DNJ得率开始下降。

(a) 乙醇体积分数

(b) 料液比

(c) 提取液pH

(d) 反应温度

图2 不同因素对桑叶DNJ提取效果的影响

Fig.2 Effects of different factors on DNJ yields from mulberry leaves

因此，选定乙醇体积分数为60%、反应pH为4.0、料液比为1∶10、提取温度为60 ℃。

2.3 正交试验确定DNJ的最佳提取因素

采用正交分析方法对DNJ提取主要影响因素进行优化。由表2可知，各因素对DNJ提取质量的影响由大到小的次序是乙醇体积分数、料液比、提取温度、提取液pH。最终确定提取条件为乙醇体积分数65%、提取液pH 3.5、料液比1∶11、提取温度55 ℃，在此条件下，得率为0.687 5 mg/g。

2.4 桑叶DNJ的纯化方法

将最佳工艺提取的样液依次经石油醚、正丁醇浓缩纯化，结果见表3。由表3可知，乙醇提取的产物经过纯化后，虽然得率稍微降低，但正丁醇纯化后，DNJ的纯度提高了20.4%，抑制率提高了19.4%。DNJ质量在石油醚纯化后略有增加，可能是因为纯化前有少量DNJ吸附到油脂上，纯化后被释放出来。

表2 影响桑叶DNJ提取因素的正交试验与极差分析

Tab.2 Orthogonal test and range analysis of factors influencing on DNJ yield from mulberry leaves

试验组φ/%pH料液比θ/℃得率/(mg·g-1)111110．638212220．640313330．651421230．658522310．682623120．642731320．709832130．658933210．709K11．9292．0051．9382．029K21．9821．9802．0071．991K32．0762．0022．0421．967k10．6430．6680．6460．676k20．6610．6600．6690．664k30．6920．6670．6810．656极差0．0490．0080．0350．020

表3 桑叶DNJ的提取和纯化

2.5 DNJ的生物特性分析

2.5.1 DNJ对蔗糖酶的抑制作用

试验组加入4 mg/mL DNJ，在不同的底物质量分数，考察了对照组与试验组的蔗糖酶活性的变化，结果见图3。如图3所示，对照组还原糖的生成量高于试验组；对照组、试验组在底物蔗糖质量分数较低时，还原糖生成量与底物蔗糖质量分数成正比关系，表现为一级反应；在蔗糖质量分数15%～25%，随着底物质量分数的增加，还原糖生成量也增加，反应表现为混合级反应；在蔗糖质量分数25%时，蔗糖酶反应能力达到最大，此后还原糖生成量不再明显增加。所以，在测定DNJ对蔗糖酶的抑制作用时，底物蔗糖的质量分数应高于25%，方可排除提取液中蔗糖的干扰。

图3 桑叶DNJ对不同底物质量分数的蔗糖酶活性的影响

以1/V为纵坐标，1/[S]为横坐标作图。根据双倒数作图法，可求出对照组和试验组的Vmax和Km，即酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。

如图4所示，与对照组的Vmax(1.424×10-4mol/(L·min)) 相比，试验组的Vmax(7.862×10-4mol/(L·min))降低了一半。Km基本保持不变。根据双倒数法作图，对照组和试验组的曲线相交，且交点在X轴上，这些特征均符合非竞争性抑制剂的特点。由此断定桑叶DNJ对蔗糖酶表现为非竞争性抑制作用，非竞争性抑制的发生有可能是DNJ与蔗糖酶-蔗糖复合物结合，抑制二糖的降解引起的[20]。

图4 不同底物浓度的蔗糖溶液酶促反应速度

2.5.2 浓缩后不同质量浓度DNJ对蔗糖酶的抑制作用

从图5可以看出，在DNJ质量浓度相同时，纯化后的抑制单位比乙醇提取的抑制单位大，正丁醇纯化后的抑制单位高于石油醚纯化后的抑制单位。在同一提取条件时，随着DNJ质量浓度增加，抑制单位增大，即DNJ对蔗糖酶的抑制作用增强，抑制率提高了19.4%。

图5 浓缩后不同质量浓度桑叶DNJ对蔗糖酶的抑制作用

Fig.5 The inhibitory effects of concentrated DNJ on sucrase at different concentrations

3 结 论

采用乙醇浸提法从桑叶中提取脱氧野尻霉素，在284 nm处测得最高吸光度，对DNJ提取质量的影响由高到低的次序是乙醇体积分数、料液比、提取温度、提取液pH。最佳工艺为乙醇体积分数65%、pH 3.5、料液比1∶11、温度55 ℃，最高得率为0.687 5 mg/g。经石油醚、正丁醇萃取纯化后，DNJ的纯度可提高20.4%，抑制率也相应地提高了19.4%。增加DNJ浓度对蔗糖酶的抑制作用也增强，DNJ对蔗糖酶的生化反应表现为非竞争性抑制。

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