紫外线对刺参体腔细胞内Ca2+浓度与凋亡的影响

丁 月, 张 晶, 田 景 玉, 姜 鹏 飞, 周 大 勇,, 宋 亮,

( 1.大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连 116034；2.大连工业大学 国家海洋食品工程技术研究中心， 辽宁 大连 116034 )

紫外线对刺参体腔细胞内Ca2+浓度与凋亡的影响

丁 月1, 张 晶1, 田 景 玉1, 姜 鹏 飞2, 周 大 勇1,2, 宋 亮1,2

( 1.大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连 116034；2.大连工业大学 国家海洋食品工程技术研究中心， 辽宁 大连 116034 )

通过激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪，检测紫外线对刺参体腔细胞内Ca2+浓度变化及凋亡的影响。将鲜活刺参随机等分3组：对照组刺参为未经UVA照射；UVA组刺参为经UVA(15 W/m2)照射30 min；药物处理-UVA组刺参为钙离子螯合剂(BAPTA-Na，IC50=1.47 mmol/L)灌入刺参体腔内后，再经UVA照射30 min。刺参经室温避光分别静置0、1、2、3和4 h后采集其体腔细胞待检。结果表明，与对照组相比，UVA组刺参体壁“化皮”程度随静置时间延长而逐渐加重，并伴随“吐肠”现象的发生；其体腔细胞内Ca2+浓度随着静置时间的延长而逐渐升高，2 h时达到最高值，随后下降；体腔细胞凋亡率在3 h后达到最高值，随后降低。药物处理-UVA组刺参体壁“化皮”程度随静置时间延长而未见明显变化；其体腔细胞内Ca2+浓度和细胞凋亡率均显著低于UVA组。推断紫外线照射刺参导致刺参体壁发生“化皮”现象，其体腔细胞内Ca2+浓度的升高促进了细胞凋亡率的上升。

刺参；体腔细胞；钙离子；细胞凋亡

0 引 言

刺参(Stichopusjaponicas)属棘皮动物(Echinodermata)，海参纲(Holothuroidea)[1]，是沿海渔业最重要的海参品种之一。刺参易受温度、盐浓度、营养物质缺乏、光照以及机械刺激等应激因素的影响，能够触发其发生“化皮”现象[2-4]。这种现象给刺参的保活保鲜储运行业带来诸多不便。研究证实，紫外线作为最重要的应激因素之一，能够诱导刺参发生“化皮”现象，且伴随细胞凋亡现象的发生[5]。但刺参细胞对紫外线刺激的生物学响应研究十分有限，此条件下细胞内Ca2+浓度与凋亡水平的研究更是鲜有报道。Ca2+是细胞内重要的第二信使，改变细胞内Ca2+浓度能够参与调控许多不同的细胞功能[6-7]。其中，细胞内Ca2+稳态的改变对细胞凋亡的调控发挥非常重要的作用，一旦细胞内Ca2+稳态被打乱，细胞内Ca2+浓度增加，引起钙超载，从而诱导细胞凋亡[8]。刺参作为海洋无脊椎动物，其体腔细胞具有气体交换、营养物质运输和贮存、凝块形成、排泄、免疫防御等功能[9-12]。海洋无脊椎动物体腔细胞作为一种环境胁迫的新型细胞生物传感器监控传感器的生物学改变，可以用来评估水生生态系统健康，也可以用来评价水产动物的鲜活程度[9,13]。因此，本研究采用紫外线(UVA)照射刺参后静置不同时间，通过激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪，检测其体腔细胞内Ca2+浓度及细胞凋亡水平的变化，同时观察刺参在静置过程中体壁“化皮”程度的变化，以探究紫外线照射对体腔细胞内Ca2+浓度与细胞凋亡变化的影响，进一步探讨刺参“化皮”现象的可能机制，以期为刺参等海珍品保活保鲜技术可控靶点的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

刺参：大连刘家桥市场购买，产自大连金州周边海域。

流式细胞仪，BD FACSVerseTM；激光扫描共聚焦显微镜，Leica DMi8；凋亡试剂盒，美国医疗器械有限公司；Ca2+荧光探针Fluo-3 AM，碧云天生物技术有限公司；钙离子螯合剂(BAPTA-Na)，艾美捷科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 实验分组

将体长(12.5±1.6) cm、体质量(128.3±7.2) g鲜活刺参随机等分为3组，每组5只。对照组为无紫外线照射的刺参；UVA组为经15 W/m2紫外线照射30 min处理的刺参；药物处理-UVA组为Ca2+螯合剂(BAPTA-Na，IC50=1.47 mmol/L)灌入刺参体腔内，再经15 W/m2紫外线照射30 min处理的刺参。每组刺参分别室温避光静置0、1、2、3和4 h。

1.2.2 刺参体腔细胞的制备

每组刺参断尾处理，收集体腔液，300目滤布过滤除杂，制备体腔细胞。

1.2.3 激光共聚焦检测体腔细胞内的游离Ca2+浓度

采用Fluo-3 AM对体腔细胞内游离Ca2+浓度进行检测。取体腔液500 μL，2 000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入HBSS溶液重悬细胞，调整细胞浓度约为1×106cells/mL，加入终浓度5 μmmol/L 的Fluo-3 AM,轻轻混匀，室温避光孵育20 min。用激光共聚焦显微镜观察，激发波长488 nm，发射波长为525～530 nm。扫描Ca2+的荧光强度，实验重复3次。

1.2.4 流式细胞仪对体腔细胞内游离Ca2+浓度的检测

Fluo-3 AM对体腔细胞内游离Ca2+标记方法同“1.2.3”。制成1×106个/mL，流式细胞仪进行检测，激发光为氩离子激光，激发波长488 nm，发射波长为525～530 nm。每组检测的细胞量在105个以上，实验重复3次。

1.2.5 流式细胞仪对体腔细胞凋亡率的检测

取体腔液500 μL，2 000 r/min离心5 min，弃去上清液，利用1×Binding Buffer制备100 μL浓度为1×106个/mL体腔细胞悬液，分别加入5 μL 的Annexin V-FITC和5 μL PI，室温避光孵育15 min，再加入400 μL的1×Binding Buffer，轻轻混匀，流式细胞仪进行检测，实验重复3次。

1.2.6 统计学分析

采用统计软件SPSS19.0对数据进行分析。正态分布的计量资料以(均数±标准差)表示，两组间比较采用t检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 UVA对刺参体腔细胞内Ca2+浓度变化的影响

2.1.1 基于激光扫描共聚焦显微镜检测体腔细胞内Ca2+浓度

利用Fluo-3 AM标记刺参体腔细胞内游离Ca2+，在激光扫描共聚焦显微镜下检测体腔细胞内游离Ca2+浓度变化的情况，如图1所示。与对照组相比较，UVA组刺参体腔细胞内游离Ca2+的荧光强度明显升高(P<0.05)，并且随着静置时间的延长而逐渐上升，静置2 h达到最高值，随后下降。药物处理-UVA组刺参体腔细胞内游离Ca2+的荧光强度虽高于对照组(P<0.05)，但显著低于UVA组刺参(P<0.05)。结果表明，UVA照射刺参能够导致其体腔细胞内游离Ca2+浓度在整个检测过程中持续保持高水平；Ca2+螯合剂灌入刺参体腔内，经UVA照射后，其体腔细胞内Ca2+浓度相比较于UVA组发生了大幅度的降低。推测刺参细胞体腔细胞内的游离Ca2+主要来源于其细胞外Ca2+。

2.1.2 基于流式细胞仪检测体腔细胞内Ca2+浓度

利用流式细胞仪检测体腔细胞内游离Ca2+浓度变化的情况，如图2所示。与对照组相比，UVA组刺参体腔细胞内游离Ca2+峰图向右迁移(图2(a))，表明Ca2+的荧光强度明显升高(P<0.05)；UVA照射后，室温避光静置0、1、2、3和4 h 的荧光强度先升高，到2 h左右达到峰值，而反应超过2 h后逐渐降低(图2(c))；定量结果表明，UVA照射刺参后，静置不同时间的体腔细胞内Ca2+浓度是对照组体腔细胞内Ca2+浓度的2倍以上。与对照组相比，药物处理组-UVA的刺参体腔细胞内游离Ca2+峰图也向右迁移(图2(b))。

(a) UVA组的Ca2+荧光成像

(b) 药物处理-UVA组的Ca2+荧光成像

(c) Ca2+荧光强度定量分析

图1 激光扫描共聚焦显微镜检测体腔细胞内游离Ca2+浓度的变化

Fig.1 Changes of Ca2+concentration in coelomocytes detected by laser scanning confocal microscopy

在室温避光静置0、1、2、3和4 h后测得的Ca2+强度荧光强度先逐渐升高，到3 h左右达到最大值，之后荧光强度逐渐降低；其体腔细胞内游离Ca2+浓度明显低于UVA组刺参体腔细胞内游离Ca2+浓度(P<0.05，图2(c))。此结果进一步验证了UVA照射刺参能够导致其体腔细胞内游离Ca2+浓度的升高。

2.2 UVA对刺参体腔细胞凋亡水平的影响

通过流式细胞仪检测UVA对刺参体腔细胞凋亡水平的影响，结果如图3所示。与对照组相比，UVA组经紫外照射后，体腔细胞凋亡率增大，并且随着静置时间的延长而逐渐增大，在静置3 h后达到最大(P<0.05，图3(a))。其中，对照组的细胞凋亡率为(6.73±0.77)%，经UVA照射，室温避光静置0、1、2、3和4 h后，测得UVA组的细胞凋亡率逐渐升高，静置3 h达到最大，随后下降，分别为(8.96±1.41)%、(12.65±1.15)%、(17.13±2.20)%、(22.48±1.75)%和(9.59±0.64)%(图3(c))。与对照组相比，药物处理-UVA组刺参体腔细胞凋亡率也呈现升高的趋势(P<0.05，图3(b))，但其在室温避光静置0、1、2、3和4 h后，测得的细胞凋亡率变化趋势与UVA组相似，分别为(7.34±2.49)%、(9.02±1.37)%、(12.57±0.70)%、(14.35±0.62)%和(9.04±0.50)%；其体腔细胞凋亡率明显低于UVA组(P<0.05，图3(c))。结果表明，UVA照射刺参能够引起其体腔细胞发生凋亡；本研究在UVA照射的同时加用了Ca2+螯合剂(BAPTA-Na，IC50=1.47 mmol/L)，发现其凋亡率虽然没有恢复正常对照水平，但UVA照射引起的体腔细胞凋亡减少，推测是由于Ca2+螯合剂抑制了刺参细胞外Ca2+进入细胞内，降低其细胞内游离Ca2+的浓度，减少了UVA对体腔细胞凋亡的促进作用，发挥一定的保护作用。

(a) UVA组Ca2+荧光强度流式峰

(b) 药物处理-UVA组Ca2+荧光强度流式峰

(c) Ca2+荧光强度定量分析

图2 流式细胞仪检测体腔细胞内游离Ca2+浓度的变化

Fig.2 Changes of Ca2+concentration in coelomocytes detected by flow cytometer

2.3 UVA对刺参体壁组织的影响

由图4可以看出，鲜活刺参未经UVA照射、室温避光静置不同时间，其体态表皮整体完好，有弹性；鲜活刺参经UVA照射30 min后，室温避光静置过程中，体表发生明显变化。经UVA照射后，刺参表皮受损；静置1 h后发生“吐肠”现象；静置3 h后参体瘫软；静置4 h后白色真皮层暴露，体壁组织出现“黏液化”现象。结果表明，刺参经UVA照射后，随着静置时间的延长，“化皮”现象逐渐加重；在这一过程中，刺参出现吐肠，体壁组织出现许多黏液，体壁原有的机械刚性变差。Ca2+螯合剂处理的刺参，经UVA照射30 min后，室温避光静置过程中，其体表弹性有所下降，但没有发生明显的损伤变化，即UVA引起的刺参体壁损伤程度明显降低。结果表明，经UVA照射，刺参体壁组织发生一定损伤，其损伤程度与此过程中体腔细胞内Ca2+浓度、凋亡水平有一定的时序性，推测UVA照射刺参发生“化皮”现象可能的原因是UVA照射导致体腔细胞内Ca2+浓度升高，引起细胞发生凋亡，进而造成刺参体壁组织一定程度上的损伤。

3 结 论

体腔细胞内Ca2+浓度主要受到胞内钙库释放和胞外钙离子进出的调节，不同时空Ca2+浓度的微小变化可以编码出复杂的信号调节网络进而影响细胞的各项功能[14]。结果发现，与对照组相比，UVA照射刺参后，体腔细胞内Ca2+浓度是对照组的2倍以上；体腔细胞凋亡率是对照组的2倍以上，且都显著高于药物处理组-UVA的；同时，UVA组刺参出现“吐肠”，参体瘫软，暴露白色真皮层现象。实验结果表明，刺参体壁发生“化皮”现象，推测出紫外线照射使体腔细胞内Ca2+浓度升高，促进了细胞凋亡，引起了刺参体壁组织损伤。

综上所述，紫外线照射导致刺参体壁发生“化皮”现象的过程中，其体腔细胞内Ca2+浓度的升高促进了细胞凋亡水平上升。本研究从Ca2+通道作为细胞感知外界环境变化应答器的角度，探讨了刺参“化皮”现象可能的机制，一定程度上对刺参等海珍品保活保鲜技术的可控靶点研究提供了指导意义。

(a) UVA组细胞凋亡流式散点图

(b) 药物处理-UVA组细胞凋亡流式散点图

(c) 细胞凋亡率的定量分析

(a) 对照组

(b) UVA组

(c) 药物处理-UVA组

图4 紫外线诱导刺参“化皮”过程中体壁组织形态的变化

Fig.4 Morphological changes of “melting” sea cucumber induced by UVA radiation

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EffectofUVAonintracellularfreecalciumconcentrationandapoptosisofseacucumberStichopusjaponicascoelomocytes

DINGYue1,ZHANGJing1,TIANJingyu1,JIANGPengfei2,ZHOUDayong1,2,SONGLiang1,2

( 1.SchoolofFoodScienceandTechnology,DalianPolytechnicUniversity,Dalian116034,China；2.NationalEngineeringResearchCenterofSeafood,DalianPolytechnicUniversity,Dalian116034,China)

Effect of UVA on intracellular free calcium concentration and apoptosis of sea cucumberStichopusjaponicascoelomocytes were investigated by laser scanning confocal microscope and flow cytometer. FreshS.japonicaswas randomly divided into 3 groups:S.japonicasin the control group was not irradiated by UVA;S.japonicasin the UVA group was irradiated by UVA with the intensity of 15 w/m2for 30 min; andS.japonicasin the Ca2+-suppression group was irradiated by UVA with the intensity of 15 w/m2for 30 min after injecting with calcium chelation agent (BAPTA sodium salt, IC50=1.47 mmol/L) into the coelomic cavity.S.japonicaswere incubated at room temperature in dark for 0, 1, 2, 3 and 4 h, respectively. Compared with the control group, the “melting” degree of body wall of UVA group was gradually increased with the prolonging incubation time, and accompanied by the phenomenon of “spit intestinal”; intracellular free calcium concentration of coelomocytes increased gradually with the prolonging incubation time, which reached the highest level after 2 h of incubation and then decreased; apoptosis rates of coelomocytes achieved the highest after 3 h of incubation and then decreased. The “melting” degree of body wall of the Ca2+-suppression group was not obvious; intracellular free calcium concentration and apoptosis rates of coelomocytes were significantly lower than UVA group. The above results indicated that the “melting” ofS.japonicasbody wall was induced by UVA irradiation, in which promoted the apoptosis of coelomocytes by the up-regulation of intracellular free calcium concentration.

Stichopusjaponicas; coelomocytes; calcium ions; apoptosis

丁月,张晶,田景玉,姜鹏飞,周大勇,宋亮.紫外线对刺参体腔细胞内Ca2+浓度与凋亡的影响[J].大连工业大学学报,2017,36(6):391-396.

DING Yue, ZHANG Jing, TIAN Jingyu, JIANG Pengfei, ZHOU Dayong, SONG Liang. Effect of UVA on intracellular free calcium concentration and apoptosis of sea cucumberStichopusjaponicascoelomocytes[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(6): 391-396.

2016-11-09.

国家自然科学基金项目(31401562)；辽宁省农业领域青年科技创新人才培养计划项目(2015002)；辽宁省教育厅科学研究一般项目(L2014220).

丁 月(1991-)，女，硕士研究生；通信作者：宋 亮(1980-)，男，讲师.

TS254.9

A

1674-1404(2017)06-0391-06