高产S-腺苷蛋氨酸的酿酒酵母发酵条件的响应面法优化

朱 靖 博, 宋 青 楠, 耿 慧 琴, 许 芹 永

( 1.大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连 116034; 2.大连博迈科技发展有限公司, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

S-腺苷蛋氨酸(SAM)有“活性甲硫氨酸”之称,于1953年被Cantoni[1]发现。SAM作为人体内最重要的甲基供体,在生命活动中,使得许多重要物质如核酸、蛋白质、脂类、碳水化合物等甲基化。SAM还是转甲基反应、转硫反应和多胺合成反应的促进剂。目前SAM的生产方法主要有化学合成法、酶促转化法、发酵法。化学合成法产率低,底物价格昂贵,产物易发生消旋,已经很少使用[2]。酶促转化法是利用SAM合成酶催化L-蛋氨酸和ATP合成SAM[3],由于细胞中SAM合成酶分离纯化困难,因此酶促法也无法应用于工业生产。发酵法成本低,易于实现,是目前工业化生产的主要手段。国外对发酵法制备SAM进行了较多的研究[4],并已实现产业化。而国内对SAM制备技术的研究起步较晚,发酵水平远低于国外。

酿酒酵母具有较强的SAM胞内积累能力,是目前工业化生产的主要菌株。本文通过对本实验室保存的酿酒酵母积累SAM能力进行考察,并对其发酵条件进行优化,提高了SAM的产量。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

酿酒酵母,菌株编号F2103,大连工业大学食品发酵微生物菌种保藏中心。

1.2 培养基

(1)固体培养基(YEPD):葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母粉10 g/L,琼脂20 g/L。

(2)种子液培养基:葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母粉10 g/L,校正至pH=6。

(3)发酵培养基:葡萄糖20 g/L,酵母粉5 g/L,硫酸铵5 g/L,磷酸二氢钾6 g/L,磷酸氢二钾3 g/L,硫酸镁1.5 g/L,L-蛋氨酸1 g/L,校正至pH=6。

1.3 培养条件

种子液制备:挑取一环菌种,接入装有30 mL种子培养基的250 mL三角瓶中,于28 ℃、180 r/min 条件下培养24 h。

发酵液制备:将种子液按照10%的接种量接入发酵培养基中,装液量为50 mL,在30 ℃,180 r/min 条件下发酵培养48 h。

1.4 分析方法

1.4.1 生物量测定方法

取5 mL发酵液4 500 r/min离心15 min收集菌体,用去离子水水洗2次,离心收集菌体,105 ℃ 烘干至恒重,称重。

1.4.2 SAM胞内产量的测定

发酵液处理:取5 mL发酵液4 500 r/min离心15 min,收集菌体,按照每克湿菌体加入0.24 mL 乙酸乙酯,0.24 mL水,振荡破碎30 min,再按照每克湿菌体加入0.56 mL 0.35 mol/L 硫酸振荡破碎1.5 h,然后将处理液10 000 r/min离心10 min收集上清液,做适当稀释后进行高效液相色谱检测。

HPLC检测条件:色谱柱为C18,流动相为40 mmol/L KH2PO4,2 mmol/L庚烷磺酸钠+体积分数18%甲醇-水,体积流量为1 mL/min,进样量为20 μL,检测波长为254 nm,柱温为室温。

1.4.3 SAM胞内产量的计算

1.5 实验方法

以SAM胞内产量作为响应值,通过3个步骤进行优化。(1)利用PB实验设计筛选出对SAM胞内产量影响显著的因素,各因素水平设计见表1。(2)利用最陡爬坡实验逼近最大响应区域。(3)利用响应面法中的Box-Behnken设计实验,通过对实验数据拟合得到二阶响应面模型,并最终确定最优发酵条件,并进行验证实验。

表1 Plackett-Burman实验设计与结果(N=12)

2 结果与讨论

2.1 PB实验确定显著影响因素

本实验采用PB实验设计对影响SAM胞内产量的因素进行了筛选,选用N=12的实验设计对8个因素(发酵温度,pH,装液量,接种量,种龄,L-Met质量浓度,摇床转速,发酵时间)进行研究,实验设计及结果如表1所示。

采用Design-Expert软件对实验数据进行方差分析(表2),获得多元一次拟合回归方程:

w(SAM)=192.98+15.44A-1.22B+

9.23D-21.58E+30.91G-

18.47H+8.83J+33.42K

表2 Plackett-Burman实验结果的方差分析表

2.2 最陡爬坡实验

根据PB实验结果设计显著影响因素的最陡爬坡路径,L-Met质量浓度为正效应,接种量和发酵时间为负效应,根据这3个因素效应大小的比例及实验结果设计其变化方向及步长进行最陡爬坡实验,结果见表3。由表3可以看出,菌株F2103发酵产SAM胞内最高产量在第二次实验附近,故选取中心点为接种量10%,L-Met质量浓度4.0 g/L,发酵时间54 h。

表3 最陡爬坡实验结果

2.3 Box-Behnken设计及响应面分析

根据最陡爬坡实验,菌株在第二次实验时进入最大产SAM区域,确定以接种量10%、L-Met质量浓度4.0 g/L、发酵时间54 h为中心点,然后对这3个因素进行Box-Behnken设计,实验中每个因素取3个水平共进行17次实验,Box-Behnken设计及结果见表4。

表4 Box-Behnken设计表及其结果

Design-Expert对Box-Behnken设计实验结果进行分析,获得拟合二次多项式回归方程:

w(SAM)=285.82-11.13A-6.97B+

12.78C-8.85AB-11.67AC+

17.01BC-39.26A2-26.76B2-

32.50C2。

表5 Box-Behnken设计实验结果的方差分析表

利用Design-Expert软件对上述模型进行优化处理,确定其发酵条件:发酵温度30 ℃,pH为6.0,装液量60 mL,接种量10%,种龄24 h,摇床转速180 r/min,L-Met质量浓度为4.0 g/L,发酵时间56 h。模型理论预测该条件下SAM胞内产量最大值为288.277 mg/g。

各因素响应曲面图见图1～3。

图1 发酵时间和接种量对SAM胞内产量影响的响应面图

Fig.1 Chart on effects of fermentation time and inoculum volume on SAM production

图2 发酵时间和L-Met质量浓度对SAM胞内产量影响的响应面图

Fig.2 Chart on effects of fermentation time and concentration of L-Met on SAM production

图3 L-Met质量浓度和接种量对SAM胞内产量影响的响应面图

Fig.3 Chart on effects of concentration of L-Met and inoculum volume on SAM production

2.4 验证实验

为了验证模型的可靠性,在最优发酵条件下进行重复实验3次,分别得到SAM的胞内产量为286.981,289.470,286.396 mg/g, SAM的胞内产量平均值为287.615 7 mg/g,与预测值288.277 mg/g 非常接近,这表明实验值和实际值间有很好的拟合性,优化模型可靠。

3 结 论

通过3种实验设计相结合,筛选出对SAM胞内产量影响显著的3个因素为接种量、L-Met质量浓度和发酵时间。得到最优发酵条件为发酵温度30 ℃,pH 6.0,装液量60 mL,接种量10%,种龄24 h,摇床转速180 r/min,L-Met 质量浓度为4.0 g/L,发酵时间56 h。在此基础上进行发酵验证,得到SAM胞内产量287.615 7 mg/g,比优化前提高了1.38倍。

[1] CANTONI G L. S-adenosyl-L-methionine:Anewineter-mediate formedenzymatically from L-methionine and adenosinetriphosphate[J]. Biological Chemistry, 1953, 204(1):403-416.

[2] MATOS J R, WONG C H. S-adenosylmethionine:stability and stabilization[J]. Bioorganic Chemistry, 1987, 15(1):71-80.

[3] CANTONI G L. The nature of the active methyl-sonor formed enzymatically from L-methinine and asenosine triphosphate[J]. Journal of American Chemical Society, 1952, 74:2942-2943.

[4] MATOS J R, RAUSHEL F M, WONG C H. S-adenosylmethionine studies on chemical and enzymatic synthesis[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry, 1987, 9(1):39-52.