紫杉醇硅胶表面分子印迹纳米颗粒的制备

付 绍 平, 李 建 华, 朱 靖 博

( 大连工业大学 植物资源化学与应用研究所, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

分子印迹技术是模仿天然抗原-抗体反应原理,制备对某一特定分子(模板分子)具有高度亲和性和特异选择性的聚合物,即分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymer, MIP)的技术。MIP一般采用本体聚合方法制备,此方法虽然简单,但存在模板分子包埋过深难以洗脱、聚合物形状不规则、机械性能低、色谱性能差等缺点[1]。分子印迹纳米材料是通过在纳米硅胶表面形成分子印迹聚合物薄层,制备出高产率、窄分布的复合粒子。通过使用这种方法,使结合位点处于表面印迹薄层之中,可较大程度上减少“包埋”现象,提高其可接近性,加速识别的动力学[2]。

紫杉醇主要存在于红豆杉属植物中,是紫杉烷类化合物的一种[3],抗癌机理独特[4],目前被用于多种癌症的一线治疗。但是由于紫杉醇在红豆杉属植物中含量十分低,而且紫杉烷类化合物结构复杂且十分相似,给紫杉醇的分离带来了巨大的困难,给日益增长的市场需求带来严重的来源危机。因此,合成对紫杉醇具有高亲和性和选择性的MIP具有重要意义。朱林敏等[5]以紫杉醇为模板分子,用本体聚合法合成了紫杉醇分子印迹聚合物,对紫杉醇有较高的结合量和结合特异性；Jianhua Li等[6]合成了以紫杉醇为模板的硅胶表面分子印迹聚合物,对紫杉醇表现了高度的结合量和特异选择性。

本研究首次以紫杉醇为模板分子,共价连接到异氰酸酯丙基三乙氧基硅烷(IPTS)上形成复合物,然后复合物与交联剂正硅酸乙酯(TEOS)通过溶胶-凝胶的方法涂覆在纳米硅胶表面上,形成纳米硅胶颗粒表面的印迹薄膜,去除模板分子即得到紫杉醇硅胶表面分子印迹纳米颗粒。

1 实 验

1.1 仪器与材料

JSM-6460LV扫描电镜,日本电子公司；高效液相色谱仪,美国DIONEX公司；SC-3610低速离心机,安徽中科中佳科学仪器有限公司；ZD-85A 气浴恒温恒速振荡器,江苏金坛市金城国胜实验仪器厂；CL-2型恒温加热磁力搅拌器,巩义市予华仪器有限责任公司。

紫杉醇,纯度>99%,大连博迈科技发展有限公司；异氰酸酯丙基三乙氧基硅烷(IPTS),纯度>99%,TCI 公司；正硅酸乙酯(TEOS),分析纯,成都市科龙化工试剂厂；二月桂酸二正丁基锡(DBDU),分析纯,成都市科龙化工试剂厂；色谱所用试剂均为市售色谱纯；其他所有试剂均为市售分析纯。

1.2 方 法

1.2.1 二氧化硅纳米颗粒的制备

根据Stober等[7]的方法,二氧化硅纳米颗粒是通过TEOS在碱性条件下水解制得,具体实验步骤如下:将4.5 mL的TEOS和80 mL正丁醇加入到250 mL的磨口锥形瓶中,在搅拌状态下,加入20 mL的氨水,反应在室温下进行24 h,在4 500 r/min 下离心15 min,得到二氧化硅纳米颗粒。

1.2.2 紫杉醇-IPTS共价结合物的制备

1.2.3 紫杉醇印迹纳米颗粒的制备

采用二氧化硅纳米颗粒表面溶胶-凝胶的方法制备紫杉醇分子印迹纳米颗粒,具体制备方法如下:将150 mg的二氧化硅纳米颗粒和7.5 mL甲醇加入到10 mL磨口锥形瓶中,超声振荡,使纳米颗粒均匀分散,然后加入 60 mg紫杉醇-IPTS复合物、0.2 mL TEOS、0.4 mL的醋酸溶液(1.0 mol·L-1),常温反应20 h得到高度交联的聚合物,4 500 r/min下离心15 min得到聚合物。放置于60 ℃真空干燥箱中干燥至恒重。

为了去除模板,将得到的聚合物加入到15 mL DMSO和3 mL水的混合溶液中,在180 ℃ 下回流5 h,产物在4 500 r/min下离心15 min 后依次通过无水THF、无水乙醇和去离子水洗涤。然后放置于60 ℃真空干燥箱中干燥至恒重,得到紫杉醇分子印迹纳米颗粒。

空白印迹聚合物的制备方法同上,只是在制备过程中不加入模板分子。

1.2.4 扫描电镜进行表征

利用扫描电子显微镜对聚合物微球的表面结构进行分析。

1.2.5 等温吸附实验

准确称取紫杉醇印迹纳米颗粒及相应的空白印迹纳米颗粒各5 mg,分别置于磨口锥形瓶中,加入不同浓度的紫杉醇-丙酮溶液2 mL,在室温下振荡反应一定时间(除动力学实验外,其余实验中的吸附时间均为20 h),用0.22 μm滤膜过滤,HPLC检测分析其浓度。根据结合前后溶液中紫杉醇的浓度变化可计算聚合物对紫杉醇的结合量Q(mg/g) ,平行测定3次取平均值。

2 结果与讨论

2.1 紫杉醇-IPTS共价结合物的制备

图1 红外图谱示意紫杉醇-IPTS形成机理

Fig.1 The FT-IR spectra of the formation mechanism of DG-IPTS complex

2.2 紫杉醇印迹纳米颗粒的制备

硅胶纳米颗粒表面的涂覆通常是由偶氮化合物或乙烯基引发进行的聚合反应[10]。但是,有机引发剂进行引发聚合而形成的表面涂覆是复杂的,因为有机引发剂的化学稳定性差,不能形成稳定的表面结构。本实验采用溶胶-凝胶反应进行硅胶纳米颗粒表面的化学涂覆。二氧化硅纳米颗粒是由TEOS水解,聚合后制备,在其表面形成了大量的羟基(—OH),为进一步涂覆做好了准备。当二氧化硅纳米颗粒均匀地分散于溶胶-凝胶反应体系中时,表面羟基可以使凝胶反应在硅胶纳米颗粒表面均匀发生,从而在母核上形成薄层结构。

尿烷键在高温下容易在异氰酸酯键和羟基键中间断裂[11],因此模板分子可以在180 ℃下通过热裂解方式除去,同时水的加入可以使异氰酸酯键水解生成与模板分子空穴相对应的氨基,从而形成了与模版分子大小吻合、结合位点一致的空穴。而纳米结构的印迹材料具有比表面积大、结合位点多、吸附容量大和传质阻力小等特点。由于印迹材料的尺寸小,印迹位点有良好的可接近性,模板分子在洗脱过程中所需要的扩散距离小,模板分子容易洗脱完全。

2.3 扫描电镜进行表征

二氧化硅纳米微球和紫杉醇印迹纳米颗粒用扫描电镜进行表征,其电镜图片见图2。两种微球的粒径大约在600 nm,印迹纳米颗粒的表面印迹厚度非常小；两种微球都是均匀的单分散的纳米微球。

2.4 紫杉醇印迹纳米颗粒的动态吸附曲线

在室温下研究了紫杉醇印迹纳米颗粒的吸附动力学行为,绘制了吸附动力学曲线如图3所示。可见,印迹纳米颗粒的吸附量在前120 min内增加迅速,之后增速变缓,6 h后基本达到平衡。

图2 二氧化硅纳米微球与紫杉醇印迹纳米颗粒的SEM图

Fig.2 SEM micrographs of silica nanospheres and paclitaxel-imprinted

图3 紫杉醇印迹纳米颗粒的动态吸附曲线

Fig.3 The kinetic uptake of paclitaxel by paclitaxel-imprinted sorbent

2.5 紫杉醇印迹纳米颗粒的静态吸附曲线

采用静态吸附法测定了紫杉醇印迹纳米颗粒及空白印迹纳米颗粒对紫杉醇的吸附等温线,吸附结果见图4。由图4可见,印迹纳米颗粒对模板分子的吸附量要明显高于空白印迹纳米颗粒,这说明两种聚合物的空间结构存在差异,在印迹过程中紫杉醇在印迹纳米颗粒中留下了与之空间结构相匹配的具有多重作用点的三维空穴,这种空穴对紫杉醇具有高度亲和力和特异识别性,所以紫杉醇印迹纳米颗粒对紫杉醇的吸附量大；而在空白印迹纳米颗粒中功能团的分布是任意的,没有形成与模板分子在空间结构上互补的空穴和结合位点,它对紫杉醇没有特异识别性,对紫杉醇的吸附主要是非特异性吸附,其吸附能力较弱,因而空白印迹纳米颗粒对紫杉醇的吸附量小。

图4 紫杉醇的等温吸附曲线

3 结 论

本实验以紫杉醇为模板分子,用溶胶-凝胶的方法合成了紫杉醇硅胶表面分子印迹纳米颗粒。所制备的模板聚合物对紫杉醇有较高的吸附容量和较好的印迹效果。

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