银杏叶多糖的制备及其抗氧化性

许 春 雨，　王　爽，　王　璐，　马 志 扬，　邹 丁 丁，　叶 淑 红，　刘　艳

(1.大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连　116034；2.江苏三仪生物工程有限公司, 江苏 邳州　221300 )



银杏叶多糖的制备及其抗氧化性

许 春 雨1，王爽1，王璐1，马 志 扬1，邹 丁 丁1，叶 淑 红1，刘艳2

(1.大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连116034；2.江苏三仪生物工程有限公司, 江苏 邳州221300 )

采用适当的料液比、提取温度、提取时间、提取pH对银杏叶进行浸提，采用Sevage法将提取液中的蛋白从粗多糖中去除，经DEAE-52和Sephadex G-100纯化得到均一多糖。以VC为参照，分别研究GBLP对超氧阴离子自由基、羟基自由基和1,1-二苯基-2-苦味酰基自由基的清除作用。结果表明，以料液比1∶40、温度100 ℃、时间4 h、pH 5.0 为提取条件时，提取率可达到12.8%。通过测定GBLP对超氧阴离子自由基、羟基自由基和1,1-二苯基-2-苦味酰基自由基的清除率可知，GBLP具有较强的抗氧化性，可作为天然抗氧化剂。

银杏叶；多糖；抗氧化性；清除率

0　引　言

银杏叶内含有重要生理和药理活性作用的功能活性成分[1-2]。近年来，由银杏开发而成的银杏提取物及其制剂是较受欢迎的天然植物制剂之一[3]。熊平源等[4]的研究表明，银杏叶提取物可通过调整CD4+/CD8+T细胞亚群的比值来增强小鼠免疫功能。目前，在银杏叶提取物抑制肿瘤方面研究也很多，从不同方面证明其具有抑制肿瘤作用[5-6]，但对于GBLP抗氧化性研究结果存在差异性。本实验以大连银杏黄叶为原料，采用水提醇沉的方式提取多糖。水溶性多糖的提取方法有热水浸提法、微波辅助法、超声波辅助法、酶法提取等[7-8]。热水浸提法成本低廉，最易进行工业化控制，故采取水提醇沉的方式制备银杏叶多糖[9]，并进一步研究其体外抗氧化性。

1　材料与方法

1.1材料

大连工业大学校园内收集的秋日银杏黄叶。

95%乙醇、丙酮、苯酚、浓硫酸、Cellulose DEAE-52、Sephadex G-100、Tris-HCl、抗坏血酸、DPPH、邻苯三酚、硫酸亚铁。

1.2方法

1.2.1银杏叶多糖的制备

将收集好的银杏叶用清水洗去表面灰尘，放入恒温鼓风干燥箱，在70 ℃条件下将叶子的水分完全烘干。用粉碎机将烘干的叶子粉碎后，过60目筛，得到细腻的银杏叶粉末。

在料液比1∶40、提取温度100 ℃、提取时间4 h、提取液pH 5.0的条件下，浸提银杏叶粉末。55 ℃旋转蒸发提取液至原体积的1/3，加入4倍体积95%的乙醇，离心取沉淀，丙酮清洗2次、95%乙醇清洗2次，少量去离子水溶解多糖沉淀，冻干备用。

1.2.2银杏叶多糖的纯化

1.2.2.1DEAE-52色谱柱的分离纯化

将GBLP配成溶液，上样于DEAE-52离子交换柱(2.2 cm×25 cm)，用0～2.0 mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，体积流量为1 mL/min。用自动部分收集器以5 mL/管收集洗脱液，隔管检测多糖(苯酚-硫酸法，A=490 nm)。

1.2.2.2 Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱的分离纯化

将Sephadex G-100装入1.6 cm×50 cm色谱层析柱中，用5 mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡。将多糖单一组分配成10 mg/mL的溶液，上样量200 mg，用Tris-HCl缓冲液(0.05 mol/L，pH 7.6) 洗脱，洗脱速度为0.3 mL/min，8 mL/管分部收集，隔管检测多糖(苯酚-硫酸法，A=490 nm)。

1.2.3银杏叶多糖的抗氧化性

取4.5 mL Tris-HCl缓冲液(pH 8.2，50 mmol/L)，于25 ℃水浴预热20 min，加入0.1 mL 不同浓度样液。将7 mmol/L邻苯三酚溶液0.4 mL加入反应体系，加入2滴10 mol/L浓盐酸终止反应。在320 nm处测定吸光度[10]，计算清除率。

清除率=[1-(A2-A1)/A0]×100%

式中：A0、A1、A2分别为空白组、对照组和样品组的吸光度。

1.2.3.2对羟基自由基(·OH)的清除作用

参照张佳佳[11]的方法，按表1依次加入试剂。混匀后于37 ℃恒温水浴中保温30 min，冷却至室温，在530 nm处测定吸光度。

表1　对·OH的清除作用的试剂列表

等体积去离子水代替样品溶液作空白对照(A0)，等体积去离子水代替样品溶液(A2)和过氧化氢溶液作对照组(A1)，计算清除率。

清除率=(A1-A2)/(A1-A0)×100%

1.2.3.3 对1,1-二苯基-2-苦味酰基自由基(DPPH·)的清除作用

参照姜波[12]的方法并加以修改，多糖样液2.0 mL，加入0.2 mmol/L的DPPH溶液2.0 mL，混匀后避光静置30 min，在517 nm处测定吸光度。以95%乙醇与样液为对照组(A1)，95%乙醇代替样品溶液为空白(A0)。以同浓度抗坏血酸作为阳性对照(A2)，计算清除率。

清除率=[1-(A2-A1)/A0]×100%

1.2.4数据分析

通过SPSS 16.0、Excel和Graph pad 5.0对数据进行整理分析。

2　结果与讨论

2.1多糖的纯化

当GBLP溶液通过Cellulose DEAE-52离子交换柱时，带负电基团的多糖能够结合到带正电的离子交换剂上，用NaCl溶液洗脱，Cl-可以将多糖组分从交换剂上置换出来，此时得到的多糖为酸性多糖，因多糖中官能团的取向、类型及数量有差异，可以利用不同离子强度的NaCl溶液进行洗脱分离。图1(a)中，2个峰分别由0.2和0.3 mol/L 的NaCl溶液洗脱得到，后者对称性较好。

使用葡聚糖凝胶色谱柱洗脱时，相对分子质量不同的多糖通过层析柱时间不同，因此根据流出时间可以对不同相对分子质量的多糖进行分离纯化。本实验中，通过DEAE-52收集到酸性多糖再经过Sephadex G-100，呈现单一对称峰，如图1(b)所示，表明GBLP为相对分子质量相对均一的组分。

(a) DEAE-52

(b) Sephadex G-100

图1GBLP的DEAE-52和Sephadex G-100洗脱曲线

Fig.1Purification results of GBLP by DEAE-52 cellulose and Sephadex G-100

2.2抗氧化性

图2　GBLP对的清除作用

2.2.2对·OH的体外清除作用

由图3可以看出，GBLP对于·OH的清除作用仅次于VC。当质量浓度由1.0 mg/mL增加到1.5 mg/mL时，GBLP对·OH清除率大幅度上升，表明GBLP具有较好的抗氧化能力。

2.2.3对DPPH·的体外清除作用

如图4所示，GBLP对DPPH·的清除作用不同于之前二者，起始清除率较高，斜率较小。当GBLP质量浓度为0.5 mg/mL时清除率即达到

图3　GBLP对·OH的清除作用

52.67%，随着GBLP质量浓度增加，清除率上升缓慢。GBLP清除DPPH·的IC50为0.36 mg/mL，VC为0.01 mg/mL。GBLP存在对DPPH·的抑制作用，说明它具有体外抗氧化活性。

图4　GBLP对DPPH·的清除作用

从图5比较可知，同一浓度的GBLP对不同的自由基清除作用不同。超氧阴离子的清除作用呈缓慢上升趋势；对于羟基自由基清除率由低到高快速升高；在遇到DPPH时，虽然清除率上升趋势较平稳，但是低浓度即可到达较高清除率。由此可见，GBLP具有一定的抗氧化性。

图5　GBLP对 、·OH、DPPH·的清除作用

3　结　论

[1] 张浩忠,刘同军,董永胜.银杏提取物研究进展[J].中国酿造,2009(1):14-18.

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[5] 陈群,杨文贵,郭丽,等.银杏叶多糖的抗肿瘤和免疫调节作用[J].中药药理与临床,2003,19(5):32-33.

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[8] 胡晓倩,唐洪华,程安阳.茶树菇多糖提取及其抗氧化性能的研究[J].湖北农业科学,2011,50(21):4465-4468.

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Preparation ofGinkgobilobapolysaccharides and its antioxidant activity

XU Chunyu1,WANG Shuang1,WANG Lu1,MA Zhi yang1,ZOU Ding ding1,YE Shu hong1,LIU Yan2

(1.School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.Jiangsu Sanyi Bioengineering Company Limited, Pizhou 221300, China )

PolysaccharideinGinkgo bilobaleaves(GBLP)waspreparedanditsantioxidationwasdetermined.GBLPwasextractedfromGinkgo bilobaleavesbywaterextractionandalcoholprecipitationandproteinswereremovedbySevagemethod.ThecrudepolysaccharideswerepurifiedbyDEAE-52andSephadexG-100.TheextractionrateofGBLPwas12.8%attheoptimalextractionconditionofsolid-liquidratio1∶40,extractiontemperature100 ℃,extractiontime4h,extractpH5.0.ResultssuggestedthatGBLPcouldbeusedasanaturalantioxidantwithhighantioxidantactivity.

Ginkgobilobaleaves; polysaccharide; antioxidant activity; scavenging rate.

许春雨,王爽,王璐,马志扬,邹丁丁,叶淑红.银杏叶多糖的制备及其抗氧化性[J].大连工业大学学报,2016,35(4):235-238.

XU Chunyu, WANG Shuang, WANG Lu, MA Zhiyang, ZOU Dingding, YE Shuhong.Preparation ofGinkgobilobapolysaccharides and its antioxidant activity[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2016, 35(4): 235-238.

2015-03-13.

国家自然科学基金资助项目(31370554).

许春雨(1991-)，女，硕士研究生；通信作者：叶淑红(1972-)，女，教授.

TS201.2

A

1674-1404(2016)04-0235-04