西洋参多糖酶解产物寡糖的纯化及鉴定

李 丽 新，　金 凤 燮，　鱼 红 闪

(大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连　116034 )



西洋参多糖酶解产物寡糖的纯化及鉴定

李 丽 新，金 凤 燮，鱼 红 闪

(大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连116034 )

对生物酶法转化西洋参多糖的产物进行分离纯化得到寡糖，并对其进行鉴定。西洋参多糖的酶解产物经Sevage法除蛋白、Sephadex G-75葡聚糖凝胶柱层析分离纯化，得到2个组分PP-1、PP-2相对分子质量约为7.5×104和6.7×103，其中PP-2为酶降解寡糖。HPLC法对PP-2进行鉴定，结果表明，PP-2为均一的寡糖，其单糖组成为葡萄糖。高碘酸氧化、Smith降解、红外光谱对PP-2的结构进行鉴定，表明PP-2为主链由α-D-(1→4)和α-D-(1→6)吡喃葡萄糖构成的葡聚糖。

西洋参多糖；生物酶法；寡糖

0　引　言

以植物来源多糖为主的天然多糖类物质，毒性极低或没有细胞毒性，对人体具有极大的利用价值，已成为医药界的热门研究对象[1]。西洋参多糖(polysaccharides inPanaxquinquefolium)具有多种药用价值[2]，但其相对分子质量大，进入人体内吸收效果较差，溶血性不好，长期注射服用很容易造成人体表面肌肤出现硬结。研究发现，多糖的水解产物也具有多种生理活性功能，还具有低热量、稳定性高及安全无毒等理化特性，由于其相对分子质量较低，很容易被人体吸收利用[3]。利用生物酶法对多糖进行转化，可切断特定糖苷键，制得特定聚合度的寡糖，产品均一性好，反应条件温和，工艺易控制，是较为理想的转化方法[4]。

目前尚无关于酶法转化西洋参多糖的深入研究。本实验对生物酶法转化西洋参多糖的产物进行分离纯化，初步鉴定其结构，为进一步研究其生物活性奠定基础。

1　材料与方法

原料与试剂：西洋参多糖酶解产物粗品，实验室自制；Sephadex G-75，美国Pharmacia公司；单糖标准品，美国Sigma公司；标准系列葡聚糖，美国Pharmacia公司；色谱纯乙腈，美国Merck公司，其余试剂均为国产分析纯。

仪器：JASCO LC-2000系列高效液相色谱仪，日本分光公司；检测器为Alltech 2000ES型蒸发光散射检测器，美国Alltech公司；GC-9A气相色谱，日本岛津公司；傅里叶变换红外光谱仪，美国珀金埃尔默公司。

1.2方法

1.2.1西洋参多糖酶解产物的分离纯化

西洋参多糖酶解产物粗品经Sevage法[5]除蛋白3次后，冷冻干燥。将冻干样品200 mg用2 mL 纯净水溶解，经Sephadex G-75葡聚糖凝胶柱分离纯化，苯酚硫酸法检测糖含量[6]。

1.2.2相对分子质量的测定

根据文献[7]的方法，取纯化后的组分各5 mg 经Sephadex G-75洗脱，得到各组分洗脱体积V。取标准系列葡聚糖Dextran T-70、T-40、T-10 和相对分子质量为4 600的葡聚糖标准品在同等条件下洗脱，得到相应标准品洗脱体积Ve。取相对分子质量200万的蓝色葡聚糖，在同等条件下洗脱，得凝胶柱空体积Vo。Ve/Vo与相应标准品相对分子质量的对数作曲线，得出回归方程，即可计算得各组分相对分子质量。

1.2.3纯度鉴定

采用高效液相色谱法鉴定纯化后寡糖纯度。色谱柱，TOSOH TSK-Gel G4000PWXL(7.8 mm×300 mm，10 μm)；流动相，纯净水，体积流量为0.5 mL/min。采用蒸发光散射检测器(ELSD)检测，温度110 ℃，上样量20 μL。

1.2.4单糖组成分析

精确称取寡糖样品20 mg，分别加入2 mL 2 mol/L H2SO4溶液，105 ℃反应8 h。反应结束后以过量BaCO3中和，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，上清液定容至5 mL。利用HPLC分析全水解样品的成分，色谱柱：Hypersil NH2(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：体积比80∶20 的乙腈-水混合液；体积流量1.0 mL/min。采用蒸发光散射检测器(ELSD)检测，温度35 ℃，上样量20 μL。得到的样品HPLC图谱出峰时间与标准单糖的HPLC图谱比较，确定寡糖样品的单糖种类。

1.2.5高碘酸氧化

高碘酸氧化[8]：称取25 mg寡糖样品溶于少量纯净水，加入12.5 mL 30 mmol/L的高碘酸钠溶液，定容至25 mL，于暗处反应，间歇振荡。间隔0、6、12、24、48、60…96 h取样0.1 mL，测定223 nm处吸光度。

甲酸生成量的测定：氧化反应完成时，取2 mL 乙二醇加入反应液消耗剩余的高碘酸。以酚酞为指示剂，测定甲酸的生成量。

根据高碘酸钠的消耗量和甲酸的生成量，可初步判断寡糖的糖苷键链接方式。

1.2.6Smith降解

方法“1.2.5”中终止反应的高碘酸氧化反应液经对流水透析48 h后，蒸馏水透析过夜，60 ℃减压浓缩至10 mL左右，加入70 mg硼氢化钠，于暗处振荡反应过夜，使糖醛还原为糖醇。再经流水透析48 h，蒸馏水透析过夜，透析液冷冻干燥。冻干样品完全酸水解后与标准品丙三醇、赤藓醇分别进行乙酰化衍生处理，经GC检测[9]。色谱条件：色谱柱HP-5(30 m×0.32 mm×0.1 μm)，柱温200 ℃；检测器为氢火焰离子(FID)检测器，温度260 ℃；载气为N2，体积流量1 mL/min；气化室温度220 ℃；上样1 μL。

1.2.7红外光谱法

称取干燥的寡糖样品粉末2 mg，研磨均匀后压成薄片在4 000～400 cm-1红外波数范围内扫描。

2　结果与讨论

2.1西洋参多糖酶解产物的分离纯化

200 mg西洋参多糖酶解产物经过Sephadex G-75柱洗脱，洗脱曲线如图1所示，有2个峰且均为单一对称峰，说明酶解产物含有2个组分且比较纯，分别命名为PP-1、PP-2，质量分数分别为8.2%和81.8%。

图1　酶解产物的洗脱曲线图

2.2酶解产物的相对分子质量

由方法“1.2.2”测定组分PP-1和PP-2的洗脱体积分别为58.1和140.6 mL。测得Sephadex G-75柱的外水体积Vo(蓝色葡聚糖)及各标准品洗脱体积Ve，结果见表1。

表1　标准品的Sephadex G-75柱洗脱体积

根据lgMr与Ve/Vo关系作图，得到的相对分子质量标准曲线方程为y=-0.306 7x+5.613 9，R2=0.997 1，可计算得2个组分PP-1、PP-2的相对分子质量分别为7.5×104和6.7×103，即PP-1为多糖，PP-2为寡糖。实验室前期测定出西洋参多糖组分PPQ-1的相对分子质量约为7.9×104[10]，与PP-1极为相近，因此可判定PP-1为少量未被酶降解的底物西洋参多糖，而底物大部分降解成了PP-2寡糖。

2.3寡糖纯度的鉴定

PP-2经HPLC检测其纯度，出现了一个对称大峰，说明为比较单一的寡糖组分，可对其结构进行进一步分析。

图2　PP-2的HPLC图谱

2.4寡糖的单糖组成

PP-2经“1.2.4”的方法全水解后，产物经HPLC检测，由图3可以看出，保留时间为8.548 min，与葡萄糖标准品保留时间8.482 min相近，则说明该寡糖组分由葡萄糖组成。

2.5高碘酸氧化结果

根据“1.2.5”的实验方法，绘制高碘酸钠消耗量标准曲线，得回归方程y=0.039 7x，R2=0.999 7。PP-2的高碘酸氧化反应过程中吸光度的变化如表2所示。由表2可知，经60 h后吸光度达到稳定，根据吸光度变化及标准曲线，可算得平均1 mol的PP-2己糖残基消耗0.635 mol的高碘酸钠。反应液经NaOH滴定有甲酸生成，据高碘酸氧化结果初步分析，该寡糖组分为葡萄糖之间以1→4和1→6糖苷键连接为主[11]。

(a) PP-2 (b) 葡萄糖标准品

表2　PP-2高碘酸氧化过程中吸光度的变化

2.6Smith降解产物分析

利用Smith降解法进一步确定寡糖组分PP-2 的糖苷键连接方式。标准品丙三醇、赤藓醇乙酰化衍生物的GC图谱分别如图4、5所示，由图知保留时间分别为4.554、8.806 min。

图4　标准品丙三醇的GC图谱

PP-2寡糖样品经高碘酸氧化、Smith降解所得的产物进行乙酰化衍生处理，GC检测结果如图6所示。由图6可知，PP-2的Smith降解产物出现保留时间为4.537、8.794 min的2个峰，与标准品丙三醇及赤藓醇的保留时间相近，结合高碘酸氧化结果，进一步说明PP-2为1→4和1→6位糖苷键连接的葡聚糖[12]。

图5　标准品赤藓醇的GC图谱

图6　PP-2的Smith降解产物的GC图谱

2.7红外光谱分析

PP-2的红外光谱图如图7所示，由图可知，PP-2红外光谱图中出现典型的糖类特征吸收峰：3 600～3 200 cm-1的羟基伸缩振动峰(O—H)；3 000～2 800 cm-1的亚甲基伸缩振动峰(C—H)，可进一步判定PP-2为糖类。

图7　PP-2的红外光谱图

除2个特征吸收峰外，图中还出现1 363.70 cm-1处的亚甲基弯曲振动吸收峰(C—H)；1 200～1 000 cm-1的吡喃环C—O—C 和C—O—H的伸缩振动特征吸收峰；960～930 cm-1的糖分子振动的特征吸收区域；844 cm-1附近的α-端基差向异构C—H变角振动；770 cm-1附近的对称环伸缩振动峰[13]。

综合PP-2红外光谱与单糖组成结果分析，可认为寡糖组分PP-2为α-D-吡喃型葡聚糖。

3　结　论

生物酶法转化后的西洋参多糖酶解产物粗品经Sevage法除蛋白，Sephadex G-75葡聚糖凝胶柱分离纯化得到2个组分PP-1、PP-2，其相对分子质量约为7.5×104和6.7×103。其中PP-1为少量未被酶降解的底物西洋参多糖，而底物大部分降解成了PP-2寡糖。通过HPLC法对PP-2进行纯度鉴定，发现PP-2为均一的寡糖，HPLC检测其全水解产物，结果表明其单糖组成为葡萄糖。高碘酸氧化、Smith降解、红外光谱法分别对PP-2的结构进行鉴定，结果表明PP-2为主链由α-D-(1→4)和α-D-(1→6)吡喃葡萄糖构成的葡聚糖。初步鉴定了西洋参多糖酶解产物寡糖的结构，为进一步研究其生物活性奠定基础。

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Purification and identification of oligosaccharide from enzymatic hydrolysis of polysaccharides inPanaxquinquefolium

LILixin,JINFengxie,YUHongshan

(School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

OligosaccharidewasobtainedbyenzymaticallydegradingpolysaccharidesinPanax quinquefolium.AfterremovedproteinscomponentsbySevagemethod,twofractionsPP-1andPP-2wereobtainedbySephadexG-75,relativemolecularweightsofwhichwereabout7.5×104and6.7×103.PP-2wasahomogeneousoligosaccharidefromenzymatichydrolysis,whichwasmainlycomposedofglucose.ResultsofMalapradereaction,SmithdegradationandIRsuggestedthatPP-2wasglucanandmainlycomposedofα-D-(1→4)andα-D-(1→6)pyranglucose.

polysaccharides inPanaxquinquefolium; biological enzymatic method; oligosaccharide

李丽新,金凤燮,鱼红闪.西洋参多糖酶解产物寡糖的纯化及鉴定[J].大连工业大学学报,2016,35(4):250-253.

LI Lixin, JIN Fengxie, YU Hongshan.Purification and identification of oligosaccharide from enzymatic hydrolysis of polysaccharides inPanaxquinquefolium[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2016, 35(4): 250-253.

2015-01-09.

“重大新药创制”科技重大专项(2012ZX09503001-003).

李丽新(1990-)，女，硕士研究生；通信作者：鱼红闪(1968-)，男，教授.

TS202.1

A

1674-1404(2016)04-0250-04