产D-丝氨酸羟基转移酶重组大肠杆菌HC-017的高密度培养条件优化

王 杨 柳，　张 春 枝，　浦 军 平

( 1.大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连　116034；2.张家港市华昌药业有限公司， 江苏 张家港　215600 )

产D-丝氨酸羟基转移酶重组大肠杆菌HC-017的高密度培养条件优化

王 杨 柳1，张 春 枝1，浦 军 平2

( 1.大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连116034；2.张家港市华昌药业有限公司， 江苏 张家港215600 )

摘要:利用D-丝氨酸羟基转移酶可催化制备D-丝氨酸，对产D-丝氨酸羟基转移酶重组大肠杆菌HC-017 的高密度培养条件进行了优化，确定最佳培养条件为：摇床转速230 r/min，摇瓶种子培养时间6 h，接种量12%，诱导时间在OD=14.0～16.0时，诱导温度28 ℃，诱导剂IPTG浓度为0.2 mmol/L。在最佳的培养条件下培养，当OD达到50时，可得的酶活为259.6 U/g(以湿菌体计)。

关键词:D-丝氨酸羟基转移酶；重组大肠杆菌；高密度培养；优化

0引言

D-丝氨酸不仅是一种重要的胶质细胞介质，还可能参与老年痴呆和精神分裂症的发病机制，可以有效改善精神分裂症患者的阳性症状和认知障碍[1-2]。D-丝氨酸很难从自然界获得，目前的制备方法主要有物理拆分法、化学拆分法及生物拆分法[3-4]。利用重组大肠杆菌高密度培养产生D-丝氨酸羟基转移酶，不仅纯度和产率较高，而且酶促反应专一性强，对大规模生产具有重要意义[5]。

本文通过对摇床转速、摇瓶种子培养时间、接种量、诱导时间、诱导温度和诱导剂浓度的实验，优化了产D-丝氨酸羟基转移酶重组大肠杆菌HC-017的高密度培养条件。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种

重组大肠杆菌HC-017，大连工业大学生物工程学院菌种保藏中心保藏。

1.1.2培养基

斜面培养基(g/L):蛋白胨10，酵母膏10，牛肉膏10，氯化钠5，琼脂20，pH7.0～7.2，121 ℃灭菌25min。

种子培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠10，pH7.0～7.2，121 ℃灭菌25min。

发酵培养基(g/L)：蛋白胨12，酵母膏24，甘油6，磷酸氢二钾12.5，磷酸二氢钾 2.43，消泡剂0.5，121 ℃灭菌25min。

补料培养基(g/L)：蛋白胨25，酵母膏100，甘油400，消泡剂 0.5，121 ℃灭菌25min。

1.2高密度培养方法

1.2.1种子培养

一级摇瓶：挑单菌落于装液量50mL的250mL摇瓶中37 ℃、230r/min培养16h。

二级摇瓶：取20mL一级种子液移入装液量400mL的2L摇瓶中37 ℃，230r/min培养6h，OD不超过4.0。

1.2.2发酵罐培养

将二级摇瓶培养好的菌种接入30L自动控制发酵罐，溶氧调至100%，温度37 ℃，流加氨水控制pH7.0～7.2，初始搅拌200r/min，通气量270L/h，罐压0.03MPa。控制溶氧在30%左右。待OD达到14.0～16.0，温度降至28 ℃时加入0.2mmol/LIPTG诱导，搅拌和罐压不变，溶氧在合适范围，继续培养至OD达到50。

1.3发酵工艺条件的优化

1.3.1最适摇床转速

分别在170、190、210、230、250r/min的条件下，测定OD，以确定最适的摇床转速。

1.3.2种子最佳培养时间

于37 ℃、230r/min培养菌种，每隔2h取1mL培养液，测定培养液的OD，绘制菌体生长曲线。

1.3.3最适接种量

取二级摇瓶种子液分别按8%、10%、12%、14%、16%的接种量，37 ℃、230r/min摇床培养8h，测定培养液的OD。

1.3.4最适诱导时间

分别在OD=8、10、12、14、16和18时进行诱导，IPTG浓度0.2mmol/L，温度28 ℃，当OD达到50时测定酶活。

1.3.5最适诱导温度

在OD=15时进行诱导，IPTG浓度0.2mmol/L，分别在24、26、28、30、32 ℃下培养，当OD达到50时测定酶活。

1.3.6IPTG的最适浓度

在OD=15时进行诱导，IPTG浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mmol/L，温度28 ℃培养，当OD达到50时测定酶活。

1.4检测方法

1.4.1酶活力测定

酶活力单位的定义：在37 ℃、pH7.3～7.4，1min内催化生成1μmolD-丝氨酸所需酶量为一个酶活力单位(U)。计算公式为：

酶活(U/g)=1 000ρVn/mMt

式中：ρ为D-丝氨酸质量浓度,mg/mL；V为最终转化液体积，mL；n为转化液稀释倍数；m为湿菌体质量，g；M为D-丝氨酸的摩尔质量，g/mol；t为时间，min。

1.4.2D-丝氨酸含量检测

利用高效液相色谱法检测产物D-丝氨酸的含量。色谱条件：色谱柱ZORBAXEclipseXDB-C8(4.6mm×150mm×5μm)；流动相A：乙酸钠溶液；流动相B：甲醇。检测条件：流动相A、B体积比75:25，体积流量1.0mL/min，波长334nm，柱温30 ℃，进样量5μL。

2结果与分析

2.1摇床转速的优化

摇床转速直接影响种子培养基中溶氧的量。不同的摇床转速对重组大肠杆菌HC-017培养的影响如图1所示。由图1可以看出，随着摇床转速的提高，OD也随之提高，当摇床转速达到230r/min时，OD达到最大值。

图1　摇床转速对菌体培养的影响

2.2种子培养时间的优化

摇瓶种子的生长曲线如图2所示。由图2可以看出，0～2h，菌种处于生长的延滞期；2～10h，菌种处于对数生长期；10～16h，菌体生长趋于平稳。当培养至6h时，菌种达到一定数量，且菌体生长繁殖能力较旺盛，因此种子的最佳培养时间为6h。

图2　摇瓶种子的生长曲线

2.3接种量的优化

接种量过大，菌体会生长过快，会使发酵液黏度增加，引起溶氧不足；接种量过小，会延长发酵周期，降低发酵罐的生产率[6]。不同接种量对菌体密度的影响如图3所示。由图3可以看出，当接种量为12%时，发酵条件最佳。

图3　接种量对菌体密度的影响

2.4诱导时间的优化

过早诱导会造成菌体浓度和酶产量偏低，同时也增加了染菌机会；诱导较晚虽可获得较高的的菌体浓度，但细胞表达外源蛋白的时间则较少[7]。在不同的时间诱导对酶活的影响如图4所示。由图4可以看出，当OD在14.0～16.0时进行诱导，酶活力最高。

图4　诱导时间对酶活的影响

2.5诱导温度的优化

温度过高会导致蛋白质或核酸的变性失活，而温度过低会使酶活受到抑制，细胞的新陈代谢活减弱[8]。不同的诱导温度对酶活的影响如图5所示，由图5可知，最适诱导温度为28 ℃。

图5　诱导温度对酶活的影响

2.6IPTG浓度的优化

不同的诱导剂IPTG的浓度对酶活力的影响如图6所示，由图6可知，当IPTG浓度为0.2mmol/L时，酶活力最高。

图6　诱导剂IPTG浓度对酶活的影响

3结论

产D-丝氨酸羟基转移酶重组大肠杆菌HC-017高密度培养的最佳条件和摇床转速230r/min，摇瓶种子培养6h，接种量12%，诱导时间在OD=14.0～16.0，诱导温度28 ℃，IPTG浓度0.2mmol/L。在最佳的工艺条件下，当OD达到50时，湿菌体的酶活为259.6U/g。

参考文献:

[1] 何文娟,阮怀珍．D-丝氨酸在神经元胶质细胞间通讯的新进展[J].生理科学进展,2009,40(4):303-307.

[2]HASHMOTOK,FUKUSHMAT,SHMIZUE,etal.PossibleroleofD-serineinpathophysiologyofAlzheimer'sdisease[J].ProgressinNeuro-PsychopharmacologyandBiologicalPsychiatry, 2004, 28(2): 385-388.

[3] 于荣华,谭娇颖,乔浩,等.化学酶法制备D-丝氨酸[J].精细化工,2013,30(5):510-512.

[4] 丁国钰,彭佳敏,郭婷婷,等.利用色氨酸酶酶法拆分D,L-丝氨酸制备D-丝氨酸[J].精细化工,2012,29(10):947-951.

[5] 柴多里,祁秋景,基木格,等.丝氨酸的研究进展[J].化工科技市场,2006,29(5):17-18.

[6] 黎鸿平,黄海婵,钟卫鸿.大肠杆菌高密度培养研究进展[J].化学与生物工程,2012,29(8):1-5.

[7] 沈毅珺,姚见儿,易进华,等.重组大肠杆菌高密度培养的进展[J].药物生物技术,2000,7(4):243-247.

[8] 王阳,张景,陈聪,等.纳豆菌液态发酵产低分子大豆蛋白肽的工艺优化[J].大连工业大学学报,2012,31(3):161-164.

OptimizationofhighdensitycultureofrecombinantE. coliHC-017toproduceD-serinehydroxyltransferase

WANGYangliu1,ZHANGChunzhi1,PUJunping2

( 1.SchoolofBiologicalEngineering,DalianPolytechnicUniversity,Dalian116034,China；2.ZhangjiagangHuachangPharmaceuticalCompanyLimited,Zhangjiagang215600,China)

Abstract:D-serine hydroxyl transferase was used to produce D-serine, and its in high density culture of recombinant E. coli HC-017 was optimized. Its optimal culture conditions were as follows: rotation speed 230 r/min, flask seed culture 6 h, inoculum 12%, induction time with OD in the range of 14.0-16.0, induction temperature 28 ℃, IPTG concentration 0.2 mmol/L. When the OD of cell culture was 50, the enzyme activity was 259.6 U/g of wet cell.

Key words:D-serine hydroxyl transferase; recombinant E. coli; high density culture; optimization

收稿日期:2015-01-03.

基金项目:辽宁省高校联合培养研究生项目(2014154)；生物技术与资源利用国家民委-教育部重点实验室开放课题.

作者简介:王杨柳(1989-)，女，硕士研究生；通信作者：张春枝(1963-)，女，教授.

中图分类号:Q939.97

文献标志码:A

文章编号:1674-1404(2016)03-0174-03