草莓衰老过程中几种酶的变化

郭 明 丽，　薛 永 常

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连　116034 )

草莓衰老过程中几种酶的变化

郭 明 丽，薛 永 常

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连116034 )

摘要:分析了草莓衰老过程中淀粉酶、纤维素酶、多聚半乳糖醛酸酶、多酚氧化酶和过氧化物酶活性的变化情况，探讨其衰老过程中酶的变化规律。结果表明，在草莓的衰老过程中，几种酶的酶活力随衰老时间呈现不同的变化。纤维素酶和多聚半乳糖醛酸酶随着衰老时间的延长而逐渐增大，其中纤维素酶活力最大，为612.16 U/g(按鲜重计算)；淀粉酶和多酚氧化酶均呈现波动性变化；而过氧化物酶在整个衰老过程中一直保持着上升趋势。

关键词:草莓；衰老；酶

0引言

草莓属蔷薇科草莓属，其果实香味浓郁，营养丰富，具有一定的抗肿瘤生物活性，对多种致癌物质有较好的抑制作用[1-2]。但极易破损被微生物感染，严重制约了草莓的货架期或贮藏寿命[3]。近年来，国内外在草莓采后贮藏保鲜方面已做了不少研究，Vicente等[4]通过热处理降低草莓在贮藏过程中的果实损伤，提高了其抗氧化能力。而γ射线辐照[5]、低温冷藏及臭氧处理可使草莓的防御酶活力增大[6]，呼吸作用降低[7]，对草莓贮藏保鲜有很好的效果。草莓衰老还与许多酶有关，如半乳糖苷酶和α-甘露糖苷酶活性随草莓果实成熟而提高，随着果实发育成熟，纤维素酶活性、果胶酶活性不断提高[8]。苏艳等[9]对果实发育过程中糖含量及糖代谢相关酶活性的变化也进行了研究。但是对草莓采后生理代谢及衰老中代谢酶的变化，特别是草莓贮藏期一些与代谢有关的酶的变化研究尚少。本实验通过对不同衰老期草莓内源淀粉酶、纤维素酶、多聚半乳糖醛酸酶、多酚氧化酶和过氧化物酶的酶活力的动态变化进行测定，发现草莓衰老过程相关酶类的变化规律，为草莓采后贮藏保鲜提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

大连市售草莓“丰香”品种，大小规格一致。选择采后衰老前期(果实一半以上转红，记作样品1)和衰老后期 (果实全红，记作样品2)两个阶段的草莓果实。

3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS)，可溶性淀粉，羧甲基纤维素钠(CMC)，果胶，儿茶酚，愈创木酚，30%过氧化氢等。

1.2方法

1.2.1酶的提取

称取草莓果肉2～8g研成匀浆，用蒸馏水定容至25mL，于4 ℃下3 500r/min离心20min，上清液即为粗酶液，用于酶活力测定。

1.2.2淀粉酶的测定

淀粉酶测定参考文献[10]的方法，得到的标准曲线回归方程为：y=0.166 1x-0.181 7, R2=0.997 4。

淀粉酶酶活定义：在37 ℃、pH5.6时，以1g样品1h水解淀粉生成1mg葡萄糖为一个酶活单位(U/g)。

淀粉酶活力=C1VT1/mV1t1

(1)

式(1)中，C1为α、β-淀粉酶共同水解淀粉生成的葡萄糖量，mg；VT1为样品稀释液总体积，mL；m为样品鲜质量，g；V1为显色所用酶液体积，mL；t1为酶作用时间，h。

1.2.3纤维素酶的测定

纤维素酶的测定参考文献[10]，得到的标准曲线回归方程为：y=0.152 7x-0.186 7，R2=0.994 8。

纤维素酶酶活定义：在50 ℃、pH5.0时，1h由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U/g)。

纤维素酶活力=5.56C2VT2/mV2t2

(2)

式(2)中，C2为羧甲基纤维素酶水解CMC生成的葡萄糖量，mg；VT2为样品稀释液总体积，mL；m为样品鲜质量，g；V2为显色所用酶液体积，mL；t2为酶作用时间，h；5.56为1mg葡萄糖的微摩尔数。

1.2.4多聚半乳糖醛酸酶的测定

多聚半乳糖醛酸酶测定参考文献[11]，将蒸馏水和糖标准液用量减半，DNS的用量为2mL，加热冷却后定容至20mL，在540nm处测吸光度。所得到的标准曲线方程为y=0.068 3x-0.091 3，R2=0.997 9。

多聚半乳糖醛酸酶酶活定义：在50 ℃、pH5.0的条件下，将1h由底物生成1μmol半乳糖醛酸所需的酶量定义为一个酶活力单位(U/g)。

多聚半乳糖醛酸酶活力=5.15C3VT3/mV

(3)

式(3)中，C3为多聚半乳糖醛酸酶水解果胶生成的半乳糖醛酸量，mg；VT3为样品稀释液总体积，mL；m为样品鲜质量，g；V3为显色所用酶液体积，mL；t3为酶作用时间，h；5.15为1mg半乳糖醛酸的微摩尔数。

1.2.5多酚氧化酶的测定

多酚氧化酶活力参考文献[12]的方法进行测定。多酚氧化酶酶活定义：以每分钟内吸光度变化0.001作为一个多酚氧化酶的活力单位(U/(g·min))。

多酚氧化酶活力=ΔA1D/0.001mt4

(4)

式(4)中，ΔA1为反应时间内吸光度的变化；t4为反应时间，min；D为稀释倍数(即提取的总酶液为反应液内酶液的倍数)；m为样品鲜质量，g。

1.2.6过氧化物酶的测定

过氧化物酶活力参考文献[13]的方法进行测定。酶活力定义：以每分钟内A470变化0.001个单位作为1个过氧化物酶活力单位(U/(g·min))。

过氧化物酶活力=ΔA2VT5/0.001mV5t5

(5)

式(5)中，ΔA2为反应时间内吸光度的变化；m为样品鲜质量，g；VT5为提取酶液总体积，mL；V5为测定时取用酶液体积，mL；t5为反应时间，min。

2结果与讨论

2.1草莓衰老过程中淀粉酶的变化

分别测定样品1和样品2在室温(20～25 ℃) 下不同保存时间的淀粉酶活力，结果如图1所示。

图1　草莓衰老过程中淀粉酶活力的变化

由图1可以看出，处于衰老前期的样品1中淀粉酶活力呈W状波动，整体呈循环上升趋势，酶活力范围10～25U/g，48h时酶活力最高，为24.3U/g；而衰老后期的样品2中，淀粉酶活力呈先下降后上升再下降的趋势，在18h时酶活力最高，为79.5U/g，总体样品1的酶活力小于样品2。淀粉作为果实发育过程中重要的碳水化合物贮藏物，在维持果实的硬度及正常生长发育中十分重要。在草莓衰老前期，果实内淀粉的含量较高，而淀粉酶活力未达高峰，随着草莓的衰老，淀粉酶的活力逐渐增强，加快了草莓果实细胞内的淀粉分解速度，果实硬度迅速下降，在衰老后期果实中的淀粉存留量逐渐降低，从而使淀粉酶的活力随淀粉含量下降，趋于稳定后停留在较低水平，这与周国忠等[14]的研究结果基本一致。

2.2草莓衰老过程中纤维素酶的变化

测定样品1和样品2在室温(20～25 ℃)下不同保存时间的纤维素酶活力的变化，结果如图2所示。

图2　草莓衰老过程中纤维素酶活力的变化

由图2可以看出，纤维素酶在草莓的衰老过程中一直保持较强的酶活力，为300～700U/g。处于衰老前期的样品1中，草莓的纤维素酶活力整体呈先上升后下降再上升的趋势，酶活力在常温保存6h时显著提高，由410.33U/g提高到562.17U/g；处于衰老后期的样品2，草莓的纤维素酶活力在0～12h略微下降，随着草莓衰老时间的延长而逐渐提高，在常温保存36h持续上升。这是因为植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶组成，纤维素酶可促进纤维素的降解从而促进了细胞壁的溶解，促进了草莓的后熟过程及后期的软化与腐烂，这与Abeles等[15]的研究结果基本一致。

2.3草莓衰老过程中多聚半乳糖醛酸酶的变化

测定了不同衰老阶段的草莓果实在不同保存时间内源多聚半乳糖醛酸酶的酶活力变化，其结果如图3所示。从图3可以看出，处于衰老前期样品1中，多聚半乳糖醛酸酶的酶活力呈先上升后下降再上升的趋势，酶活力在常温保存6h时有显著提高；衰老后期的样品2中，多聚半乳糖醛酸酶的活力却呈先下降后上升再下降而后趋于平稳的趋势。在草莓成熟过程中，多聚半乳糖醛酸酶能降解果胶使细胞壁破损，因此果实成熟前期的合成显著增加，能使果实变红变软，但不利于保鲜。在草莓衰老阶段，由于前期酶的作用已使果实细胞完全解离，此时的多聚半乳糖醛酸酶活性保持在较平稳的动态水平。

图3草莓衰老过程中多聚半乳糖醛酸酶活力的变化

Fig.3Changes of polygalacturonase activity during strawberry senescence

2.4草莓衰老过程中多酚氧化酶的变化

测定了不同衰老阶段的草莓果实在不同保存时间内源多酚氧化酶的变化，如图4所示。

图4　草莓衰老过程中多酚氧化酶活力的变化

由图4可以看出，样品1的多酚氧化酶活力在衰老前期变化不大，在36h后有上升趋势，而样品2的酶活力变化趋势是先上升后下降，在36h后趋于平缓。处于成熟衰老前期的样品1的多酚氧化酶的活性整体高于衰老后期的样品2，说明随着果实的成熟及衰老，多酚氧化酶的活性逐渐增大。多酚氧化酶作为植物体内普遍存在的一种非线粒体内的末端呼吸氧化酶[12]，在草莓成熟衰老前期，促进果实成熟的主要因子是内部乙烯的产生，呼吸作用保持平稳甚至有下降趋势。随着草莓果实的成熟后的逐渐衰老，果实呼吸作用加强，表现为多酚氧化酶活性的逐渐增加，在衰老的后期，随着果实的染菌及腐烂，呼吸作用再度增加，多酚氧化酶的活性又出现了新的高峰，进一步加快了草莓果实的衰老进程。但是相比其他酶类，多酚氧化酶在草莓的衰老过程中的作用较小。

2.5草莓衰老过程中过氧化物酶的变化

不同衰老阶段的草莓果实在不同保存时间的过氧化物酶活力变化，如图5所示。

图5　草莓衰老过程中过氧化物酶的变化

从图5可以看出，草莓衰老过程中过氧化物酶的活力整体都呈上升趋势，且衰老后期的样品2中，过氧化物酶活力大于衰老前期的样品1，且随草莓的成熟衰老而逐渐增大。草莓为不具有呼吸骤变的非骤变型果实，随着草莓果实的逐渐衰老及衰老后期的染菌与腐烂，过氧化物酶活性增大，这与该酶作为组织老化的一种生理指标是一致的。

3结论

在草莓的衰老进程中，纤维素酶和多聚半乳糖醛酸酶是草莓衰老的主要因素，其最大酶活力分别为612.16和237.42U/g，由于这两种酶分解细胞壁直接导致了果实软化及衰老。而多酚氧化酶随着草莓的衰老和染菌腐烂，酶活力在小范围内逐渐上升(由2.50U/g上升到4.06U/g)，与其他酶相比多酚氧化酶的活力更低。过氧化物酶作为植物在逆境条件下酶促防御系统的关键酶之一，随着草莓的衰老，其酶活力整体为上升趋势(由11.88U/g上升到26.56U/g)，这可以作为果实进入衰老后期的一个标志。可以看出草莓衰老与许多内源酶的活性相关，合理控制相关酶的活性对于延长草莓的货架期具有重要的指导作用。

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Changesinenzymesactivitiesduringstrawberrysenescenceprocess

GUOMingli,XUEYongchang

(SchoolofBiologicalEngineering,DalianPolytechnicUniversity,Dalian116034,China)

Abstract:Changes in activities of amylase, cellulase, polygalacturonase, polyphenol oxidase and peroxidase during strawberry senescence were determined. The enzymes activities showed different changes in different aging stages. Cellulase and polygalacturonase were gradually increased with the aging time and cellulase activity could reach to 612.16 U/g fresh weight. There were fluctuation in amylase and polyphenol oxidase, and the activity of peroxidase increased in the total senescence process.

Key words:strawberry; senescence; enzyme

收稿日期:2015-03-03.

作者简介:郭明丽(1990-)，女，硕士研究生；通信作者：薛永常(1966-)，男，教授，E-mail:xueych@dlpu.edu.cn.

中图分类号:TS255.3；Q945.65

文献标志码:A

文章编号:1674-1404(2016)03-0185-05